| 致谢 | 第5-6页 |
| 摘要 | 第6-7页 |
| ABSTRACT | 第7-8页 |
| 1 文献综述 | 第14-20页 |
| 1.1 黄曲霉概述 | 第14页 |
| 1.1.1 黄曲霉的生物特性及危害 | 第14页 |
| 1.1.2 黄曲霉毒素及其危害 | 第14页 |
| 1.2 农杆菌介导丝状真菌遗传转化研究的进展 | 第14-18页 |
| 1.2.1 农杆菌简介 | 第14页 |
| 1.2.2 农杆菌介导的遗传转化的分子机理 | 第14-15页 |
| 1.2.3 农杆菌介导丝状真菌遗传转化的过程 | 第15页 |
| 1.2.4 用于介导转化的农杆菌种类及常用选择性标记 | 第15-16页 |
| 1.2.5 影响农杆菌介导丝状真菌遗传转化的效率的因素 | 第16-17页 |
| 1.2.6 农杆菌介导丝状真菌遗传转化的特点 | 第17-18页 |
| 1.2.7 ATMT的应用 | 第18页 |
| 1.3 黄曲霉菌遗传转化的研究进展 | 第18-19页 |
| 1.4 GFP在真菌遗传转化中的应用 | 第19-20页 |
| 2 引言 | 第20-22页 |
| 2.1 本研究的目的意义 | 第20页 |
| 2.2 本研究的主要内容 | 第20-21页 |
| 2.3 研究的技术路线 | 第21-22页 |
| 3 材料与方法 | 第22-38页 |
| 3.1 供试菌株与质粒 | 第22页 |
| 3.2 供试培养基 | 第22-23页 |
| 3.3 主要试剂与酶 | 第23页 |
| 3.4 主要仪器设备 | 第23-24页 |
| 3.5 供试菌株的培养及保存 | 第24页 |
| 3.5.1 大肠杆菌 | 第24页 |
| 3.5.2 农杆菌菌株 | 第24页 |
| 3.5.3 黄曲霉菌 | 第24页 |
| 3.6 菌丝体的培养及收集 | 第24-25页 |
| 3.7 引物的设计 | 第25-26页 |
| 3.8 双元表达载体的构建 | 第26-27页 |
| 3.8.1 双元表达载体pDHB2的构建 | 第26页 |
| 3.8.2 双元表达载体pDHB/G的构建 | 第26-27页 |
| 3.8.3 双元表达载体pDHBG的构建 | 第27页 |
| 3.9 双元表达载体转入农杆菌 | 第27-28页 |
| 3.9.1 农杆菌感受态细胞制备 | 第27-28页 |
| 3.9.2 重组质粒冻融法转化农杆菌 | 第28页 |
| 3.10 农杆菌介导黄曲霉遗传转化体系的优化 | 第28页 |
| 3.11 DAPI染色及观察 | 第28-29页 |
| 3.12 CTAB法提基因组 | 第29页 |
| 3.13 转化子的分子鉴定 | 第29-33页 |
| 3.13.1 转化子的PCR验证 | 第29-30页 |
| 3.13.2 Southern杂交 | 第30-32页 |
| 3.13.3 Western杂交 | 第32-33页 |
| 3.14 转化子的荧光观测 | 第33页 |
| 3.15 转化子稳定性检测 | 第33页 |
| 3.16 转化子的表型分析及突变体筛选 | 第33-35页 |
| 3.16.1 转化子的生长 | 第33页 |
| 3.16.2 转化子孢子颜色分析 | 第33-34页 |
| 3.16.3 转化子产孢能力的测定 | 第34页 |
| 3.16.4 转化子产毒能力的测定 | 第34页 |
| 3.16.5 转化子侵染能力分析 | 第34-35页 |
| 3.17 TAIL-PCR | 第35-38页 |
| 3.17.1 TAIL-PCR扩增体系 | 第35-36页 |
| 3.17.2 TAIL-PCR的扩增条件 | 第36页 |
| 3.17.3 TAIL-PCR片段的克隆 | 第36-38页 |
| 4 结果与分析 | 第38-51页 |
| 4.1 黄曲霉单核孢子分离 | 第38页 |
| 4.2 不同培养基对黄曲霉抗生素敏感性的影响 | 第38-39页 |
| 4.3 PgpdA和PtrpC启动子比较 | 第39-40页 |
| 4.4 农杆菌介导黄曲霉遗传转化体系的优化 | 第40-41页 |
| 4.4.1 共培养温度对转化效率的影响 | 第40页 |
| 4.4.2 共培养时间对转化效率的影响 | 第40页 |
| 4.4.3 黄曲霉孢子浓度对转化效率的影响 | 第40页 |
| 4.4.4 农杆菌浓度对转化效率的影响 | 第40-41页 |
| 4.5 转化子的PCR及杂交验证 | 第41-42页 |
| 4.6 绿色荧光蛋白转化黄曲霉菌及其表达 | 第42-47页 |
| 4.6.1 非融合表达载体pDHB/G的构建 | 第42-43页 |
| 4.6.2 融合表达载体pDHBG的构建 | 第43-44页 |
| 4.6.3 荧光检测 | 第44-45页 |
| 4.6.4 含GFP转化子的分子检测 | 第45-46页 |
| 4.6.5 转化子的稳定性分析 | 第46-47页 |
| 4.7 转化子中T-DNA插入拷贝数分析 | 第47页 |
| 4.8 突变体表型筛选 | 第47-50页 |
| 4.9 TAIL-PCR分析T-DNA插入侧翼序列 | 第50-51页 |
| 5 讨论 | 第51-53页 |
| 5.1 孢子受体对转化的影响 | 第51页 |
| 5.2 启动子对异源基因在黄曲霉中表达的影响 | 第51页 |
| 5.3 转化条件的优化 | 第51-52页 |
| 5.4 ble和gfp融合与非融合表达的比较 | 第52页 |
| 5.5 T-DNA插入拷贝数分析 | 第52页 |
| 5.6 关于TAIL-PCR | 第52-53页 |
| 6 结论 | 第53-54页 |
| 7 参考文献 | 第54-59页 |
| 作者简介 | 第59页 |
