| 摘要 | 第12-14页 |
| Abstract | 第14-15页 |
| 第一章 前言 | 第16-24页 |
| 1. 常见的心衰标志物 | 第16-19页 |
| 1.1. B型利钠肽 | 第16-17页 |
| 1.2. 氨基末端B型利钠肽 | 第17页 |
| 1.3. 半乳糖凝集素3 | 第17-18页 |
| 1.4. 肌钙蛋白 | 第18页 |
| 1.5. 脂联素 | 第18-19页 |
| 1.6. 循环中的微小RNA (miRNA) | 第19页 |
| 2. 新兴的心衰标志物sST2 | 第19-21页 |
| 2.1. sST2生物学特性 | 第19页 |
| 2.2. IL-3 3/ST2L通路 | 第19-20页 |
| 2.3. sST2临床意义 | 第20-21页 |
| 2.4. sST2作为心衰标志物的优势 | 第21页 |
| 3. 单克隆抗体技术 | 第21-22页 |
| 4. 酶联免疫分析技术 | 第22页 |
| 5. 研究的目的和意义 | 第22页 |
| 6. 研究内容与技术路线 | 第22-24页 |
| 6.1. 主要研究内容 | 第22-23页 |
| 6.2. 技术路线 | 第23-24页 |
| 第二章 材料与方法 | 第24-41页 |
| 1. 材料 | 第24-29页 |
| 1.1. 主要仪器 | 第24-25页 |
| 1.2. 主要试剂和材料 | 第25-27页 |
| 1.3. 常用溶液和培养基的配置 | 第27-29页 |
| 1.3.1. 大肠杆菌LB培养基的配置 | 第27页 |
| 1.3.2. 碱裂解法质粒抽提液 | 第27-28页 |
| 1.3.3. 蛋白纯化常用溶液配置 | 第28-29页 |
| 1.3.4. RPMI-1640培养基的配置 | 第29页 |
| 1.3.5. ELISA试剂 | 第29页 |
| 2. 方法 | 第29-41页 |
| 2.1. 基因克隆的构建 | 第29-32页 |
| 2.1.1. PCR扩增反应 | 第29-30页 |
| 2.1.2. 小量质粒快速提取 | 第30页 |
| 2.1.3. 酶切方法 | 第30-31页 |
| 2.1.4 胶回收试剂盒回收片段 | 第31页 |
| 2.1.5. 目的片段与载体连接 | 第31-32页 |
| 2.1.6. 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第32页 |
| 2.1.7. 质粒DNA的转化 | 第32页 |
| 2.2. sST2蛋白表达及纯化 | 第32-35页 |
| 2.2.1. 重组蛋白的小量诱导表达 | 第32-33页 |
| 2.2.2. 重组蛋白的大量诱导表达 | 第33页 |
| 2.2.3. SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) | 第33-34页 |
| 2.2.4. 蛋白质的纯化 | 第34-35页 |
| 2.2.4.1. 包涵体的洗涤纯化 | 第34-35页 |
| 2.2.4.2. 重组蛋白的Ni-Sepharose亲和层析纯化 | 第35页 |
| 2.3. 单克隆抗体的制备 | 第35-38页 |
| 2.3.1. 小鼠的常规基础免疫 | 第35-36页 |
| 2.3.2. 脾脏免疫 | 第36页 |
| 2.3.3. 细胞融合 | 第36页 |
| 2.3.4. 单克隆细胞的筛选 | 第36-37页 |
| 2.3.5. 单克隆细胞的扩大培养 | 第37页 |
| 2.3.6. 细胞冻存 | 第37页 |
| 2.3.7. 细胞复苏 | 第37页 |
| 2.3.8. 细胞换液 | 第37页 |
| 2.3.9. 细胞传代 | 第37-38页 |
| 2.3.10. 单克隆抗体的生产 | 第38页 |
| 2.3.11. 单克隆抗体的纯化 | 第38页 |
| 2.4. sST2 ELISA试剂盒的研发 | 第38-40页 |
| 2.4.1. 间接ELISA法 | 第38-39页 |
| 2.4.2. 单克隆抗体连接生物素 | 第39页 |
| 2.4.3. 双抗体夹心法ELISA反应步骤 | 第39-40页 |
| 2.5. 病例选择和统计分析 | 第40-41页 |
| 第三章 结果与分析 | 第41-62页 |
| 1. sST2基因的克隆 | 第41-44页 |
| 1.1. 目的片段的扩增 | 第41页 |
| 1.2. sST2重组质粒的构建 | 第41-43页 |
| 1.3. sST2重组质粒转大肠杆菌DH5α | 第43页 |
| 1.4. sST2重组质粒转大肠杆菌BL21 | 第43-44页 |
| 2. sST2蛋白的表达纯化 | 第44-46页 |
| 2.1. sST2全长蛋白的表达纯化 | 第44页 |
| 2.2. sST2 19-103片段蛋白的表达纯化 | 第44-45页 |
| 2.3. sST2 114-197片段蛋白的表达纯化 | 第45-46页 |
| 2.4. sST2 212-319片段蛋白的表达纯化 | 第46页 |
| 3. 蛋白浓缩和浓度的测定 | 第46-47页 |
| 4. sST2单克隆抗体的制备 | 第47-49页 |
| 4.1. 抗原免疫小鼠血清滴度的测定 | 第47-48页 |
| 4.2. sST2单克隆抗体的筛选 | 第48页 |
| 4.3. sST2单克隆抗体的效价评估 | 第48-49页 |
| 5. sST2单克隆抗体的亚型测定 | 第49-51页 |
| 6. sST2酶联免疫分析(ELISA)检测试剂盒的构建 | 第51-55页 |
| 6.1. 双抗体夹心法筛选sST2单克隆抗体配对 | 第51-52页 |
| 6.2. 不同反应体系的选择 | 第52-53页 |
| 6.3. 生物素标记抗体和SA-HRP工作浓度的选择 | 第53-54页 |
| 6.4. 标准曲线和线性范围的确定 | 第54-55页 |
| 7. 性能验证 | 第55-58页 |
| 7.1. 相关性比较 | 第55-56页 |
| 7.2. 回收率 | 第56-57页 |
| 7.3. 批内不精密度评价 | 第57页 |
| 7.4. 批间不精密度评价 | 第57-58页 |
| 8. sST2在心力衰竭中的诊断价值研究 | 第58-59页 |
| 9. sST2和NT-proBNP与肾功能相关性的研究 | 第59-62页 |
| 9.1. sST2和NT-proBNP与肌酐相关性 | 第59-60页 |
| 9.2. sST2和NT-proBNP与GFR相关性 | 第60-61页 |
| 9.3. 比较sST2和NT-proBNP在肾功能异常组和正常组血清水平的差异 | 第61-62页 |
| 第四章 讨论 | 第62-67页 |
| 1. sST2抗原的制备 | 第62-63页 |
| 2. sST2单克隆抗体的制备 | 第63-64页 |
| 3. sST2双抗体夹心试剂盒的构建 | 第64-65页 |
| 4. sST2在心力衰竭中的应用价值 | 第65-67页 |
| 第五章 结论 | 第67-68页 |
| 参考文献 | 第68-81页 |
| 致谢 | 第81页 |
