| 摘要 | 第9-13页 |
| Abstract | 第13-17页 |
| 缩略词表 | 第18-19页 |
| 第一章 文献综述 | 第19-31页 |
| 1 磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）的研究进展 | 第19-22页 |
| 1.1. PI3K的分类与分子特征 | 第19-20页 |
| 1.2 PI3K的表达 | 第20-21页 |
| 1.3 PI3K启动子研究进展 | 第21-22页 |
| 1.3.1 启动子的结构特点 | 第21-22页 |
| 1.3.2 PI3K的转录调控研究 | 第22页 |
| 2 鱼类胰岛素信号系统关键蛋白的研究进展 | 第22-26页 |
| 2.1 胰岛素 | 第23-24页 |
| 2.2 胰岛素受体 | 第24-25页 |
| 2.3 胰岛素受体底物 | 第25-26页 |
| 3 胰岛素对鱼类脂代谢调控的研究进展 | 第26-29页 |
| 4 本研究的目的及意义 | 第29-31页 |
| 第二章 黄颡鱼pi3k家族基因的克隆及组织表达分析 | 第31-45页 |
| 1 前言 | 第31页 |
| 2 材料与方法 | 第31-36页 |
| 2.1 实验鱼的饲养及样品采集 | 第31-32页 |
| 2.2 实验试剂 | 第32页 |
| 2.3 不同亚型pi3ks基因c DNA序列的克隆 | 第32-34页 |
| 2.3.1 总RNA的提取及第一链c DNA的合成 | 第32页 |
| 2.3.2 黄颡pi3ks基因c DNA核心序列的克隆及测序 | 第32页 |
| 2.3.3 黄颡鱼pi3ks基因c DNA 3’和 5’末端的克隆及测序 | 第32-34页 |
| 2.4 序列分析 | 第34-35页 |
| 2.5 黄颡鱼pi3ks基因的组织表达分析 | 第35页 |
| 2.6 统计分析 | 第35-36页 |
| 3 结果与分析 | 第36-43页 |
| 3.1 黄颡鱼不同亚型pi3ks的c DNA序列特征 | 第36页 |
| 3.2 黄颡鱼不同亚型pi3ks基因分类和氨基酸序列特征 | 第36-38页 |
| 3.3 黄颡鱼不同亚型pi3ks进化分析 | 第38-41页 |
| 3.4 黄颡鱼不同亚型pi3ks的组织表达水平 | 第41-43页 |
| 4 讨论 | 第43-44页 |
| 5 小结 | 第44-45页 |
| 第三章 黄颡鱼pi3kca、pi3kc2b和pi3kc3启动子克隆及其功能研究 | 第45-69页 |
| 1 前言 | 第45页 |
| 2 材料与方法 | 第45-57页 |
| 2.1 黄颡鱼及细胞系 | 第45-46页 |
| 2.2 实验试剂 | 第46页 |
| 2.3 黄颡鱼pi3kca、pi3kc2b和pi3kc3启动子的克隆 | 第46-47页 |
| 2.3.1 黄颡鱼DNA的提取 | 第46页 |
| 2.3.2 黄颡鱼pi3kca、pi3kc2b和pi3kc3第一内含子位置的确定 | 第46页 |
| 2.3.3 Hitail-PCR克隆黄颡鱼pi3kca、pi3kc2b和pi3kc3启动子 | 第46-47页 |
| 2.4 序列分析 | 第47-48页 |
| 2.5 pi3kca、pi3kc2b和pi3kc3启动子区 5`缺失片段载体构建 | 第48-49页 |
| 2.5.1 pi3kca、pi3kc2b和pi3kc3的 5`缺失片段的扩增 | 第48-49页 |
| 2.5.2 启动子缺失片段与表达载体的酶切、重组连接、转化与质粒抽提 | 第49页 |
| 2.6 细胞转染 | 第49-50页 |
| 2.6.1 细胞培养 | 第49页 |
| 2.6.2 质粒转染 | 第49-50页 |
| 2.7 双荧光素酶活检测 | 第50页 |
| 2.7.1 细胞收集 | 第50页 |
| 2.7.2 双荧光素酶活分析 | 第50页 |
| 2.8 定点突变 | 第50-52页 |
| 2.8.1 突变载体构建 | 第50-51页 |
| 2.8.2 突变载体与表达载体的酶切、转化和质粒抽提 | 第51-52页 |
| 2.8.3 细胞转染与荧光素酶活性测定 | 第52页 |
| 2.9 凝胶迁移阻滞分析（EMSA） | 第52-56页 |
| 2.9.1 探针的制备 | 第52-53页 |
| 2.9.2 核蛋白提取和蛋白浓度测定 | 第53-54页 |
| 2.9.3 EMSA结合反应和化学发光检测 | 第54-56页 |
| 2.10 统计分析 | 第56-57页 |
| 3 结果与分析 | 第57-66页 |
| 3.1 pi3kca、pi3kc2b和pi3kc3启动子序列分析 | 第57-59页 |
| 3.2 pi3kca、pi3kc2b和pi3kc3的 5’缺失载体启动子活性分析 | 第59-61页 |
| 3.3 FOXO1抑制剂AS1842856对pi3kca、pi3kc2b和pi3kc3启动子活性的影响 | 第61页 |
| 3.4 定点突变分析 | 第61-63页 |
| 3.5 EMSA分析 | 第63-66页 |
| 4 讨论 | 第66-68页 |
| 5 小结 | 第68-69页 |
| 第四章 黄颡鱼pi3kca启动子甲基化特征的初步研究 | 第69-77页 |
| 1 前言 | 第69页 |
| 2 材料与方法 | 第69-72页 |
| 2.1 实验试剂 | 第69页 |
| 2.2 黄颡鱼的养殖 | 第69-70页 |
| 2.3 DNA和RNA提取 | 第70页 |
| 2.4 基因组DNA甲基化修饰 | 第70-71页 |
| 2.5 PCR硫化模板扩增和测序 | 第71页 |
| 2.6 pi3kca启动子甲基化程度统计分析 | 第71页 |
| 2.7 基因表达分析 | 第71页 |
| 2.8 统计分析 | 第71-72页 |
| 3 实验结果与分析 | 第72-76页 |
| 3.1 pi3kca启动子Cp G岛序列 | 第72页 |
| 3.2 不同组织pi3kca的Cp G位点甲基化程度 | 第72页 |
| 3.3 不同组织pi3kca的基因表达水平和甲基化水平 | 第72页 |
| 3.4 不同组织dnmts的基因表达 | 第72-76页 |
| 4 讨论 | 第76页 |
| 5 小结 | 第76-77页 |
| 第五章 胰岛素激活IRS-PI3K-AKT信号通路调控黄颡鱼脂代谢的机制研究 | 第77-92页 |
| 1 前言 | 第77-78页 |
| 2 材料和方法 | 第78-82页 |
| 2.1 实验试剂 | 第78页 |
| 2.2 实验设计 | 第78-80页 |
| 2.2.1 离体实验：胰岛素对IRS-PI3K-AKT信号通路以及对肝细胞脂代谢的影响 | 第78-80页 |
| 2.2.2 活体实验：腹腔注射胰岛素对黄颡鱼肝脏脂代谢的影响 | 第80页 |
| 2.3 样品分析 | 第80-82页 |
| 2.3.1 肝细胞TG含量的测定 | 第80-81页 |
| 2.3.2 肝脏油红O染色 | 第81页 |
| 2.3.3 脂代谢关键酶酶活测定 | 第81-82页 |
| 2.3.4 基因表达分析 | 第82页 |
| 2.4 统计分析 | 第82页 |
| 3 实验结果与分析 | 第82-88页 |
| 3.1 胰岛素对肝细胞存活率和TG含量的影响 | 第82-83页 |
| 3.2 胰岛素对肝细胞不同亚型IRS-PI3K-AKT基因表达的影响 | 第83页 |
| 3.3 胰岛素对肝细胞脂代谢相关酶酶活的影响 | 第83-85页 |
| 3.4 胰岛素对肝细胞脂代谢相关基因表达的影响 | 第85页 |
| 3.5 腹腔注射胰岛素对黄颡鱼肝脏脂肪沉积的影响 | 第85-87页 |
| 3.6 腹腔注射胰岛素对黄颡鱼肝脏脂代谢相关酶酶活的影响 | 第87页 |
| 3.7 腹腔注射胰岛素对黄颡鱼肝脏脂代谢相关基因表达的影响 | 第87-88页 |
| 4 讨论 | 第88-90页 |
| 5 小结 | 第90-92页 |
| 第六章 PI3K和FOXO1信号通路在胰岛素调控黄颡鱼脂代谢中的作用 | 第92-100页 |
| 1 前言 | 第92页 |
| 2 材料与方法 | 第92-94页 |
| 2.1 实验试剂 | 第92-93页 |
| 2.2 黄颡鱼肝细胞的分离 | 第93页 |
| 2.3 实验处理 | 第93页 |
| 2.4 肝细胞存活率和TG含量的测定 | 第93页 |
| 2.5 基因表达分析 | 第93-94页 |
| 2.6 统计分析 | 第94页 |
| 3 结果与分析 | 第94-98页 |
| 3.1 Wortmannin和AS1842856对肝细胞存活率的影响 | 第94页 |
| 3.2 Wortmannin和AS1842856对黄颡鱼肝细胞pi3ks表达水平的影响 | 第94-96页 |
| 3.3 Wortmannin和AS1842856对胰岛素诱导肝细胞TG合成的影响 | 第96页 |
| 3.4 Wortmannin和AS1842856对胰岛素诱导肝细胞脂代谢相关基因表达的影响 | 第96-98页 |
| 4 讨论 | 第98-99页 |
| 5 小结 | 第99-100页 |
| 第七章 总结与展望 | 第100-103页 |
| 1 总结 | 第100-101页 |
| 2 展望 | 第101-103页 |
| 参考文献 | 第103-123页 |
| 附录1：本实验中所用到的荧光定量PCR引物 | 第123-124页 |
| 附录2: 论文发表与奖励 | 第124-127页 |
| 致谢 | 第127-129页 |
