| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5页 |
| 1 前言 | 第9-19页 |
| 1.1 TMEPAI概述 | 第9-10页 |
| 1.1.1 TMEPAI(Transmembrane prostate androgen-induced protein) | 第9页 |
| 1.1.2 TMEPAI与Nedd4家族蛋白 | 第9-10页 |
| 1.2 蛋白质泛素化修饰 | 第10-13页 |
| 1.2.1 泛素概述 | 第10-11页 |
| 1.2.2 泛素化概述 | 第11-12页 |
| 1.2.3 蛋白质单泛素化和多泛素化修饰 | 第12-13页 |
| 1.2.4 蛋白质聚泛素化修饰 | 第13页 |
| 1.3 泛素化修饰与膜泡运输 | 第13-15页 |
| 1.3.1 蛋白膜泡运输 | 第13-14页 |
| 1.3.2 泛素结合蛋白 | 第14-15页 |
| 1.3.3 蛋白质泛素化与酵母胁迫应答 | 第15页 |
| 1.4 蛋白质相互作用的研究方法 | 第15-16页 |
| 1.4.1 GST pull-down技术 | 第15页 |
| 1.4.2 酵母双杂交技术 | 第15-16页 |
| 1.4.3 免疫共沉淀技术 | 第16页 |
| 1.5 蛋白复合物的分离 | 第16页 |
| 1.6 蛋白质泛素化与癌症治疗 | 第16-17页 |
| 1.7 本论文研究内容与意义 | 第17-19页 |
| 1.7.1 本论文研究内容 | 第17-18页 |
| 1.7.2 本论文研究意义 | 第18-19页 |
| 2 材料与方法 | 第19-39页 |
| 2.1 实验材料 | 第19-26页 |
| 2.1.1 菌株、质粒载体与细胞株 | 第19页 |
| 2.1.2 相关试剂 | 第19-21页 |
| 2.1.3 主要仪器和设备 | 第21-22页 |
| 2.1.4 主要的PCR引物 | 第22-23页 |
| 2.1.5 常用培养基 | 第23-24页 |
| 2.1.6 常用溶液 | 第24-26页 |
| 2.2 实验方法 | 第26-39页 |
| 2.2.1 哺乳动物细胞总RNA提取 | 第26页 |
| 2.2.2 酿酒酵母总RNA提取 | 第26-27页 |
| 2.2.3 cDNA片段获取 | 第27页 |
| 2.2.4 基因克隆 | 第27页 |
| 2.2.5 基因克隆与重组质粒构建 | 第27-30页 |
| 2.2.6 溶酶体蛋白TMEPAI泛素化 | 第30-32页 |
| 2.2.7 GST pull-down实验 | 第32页 |
| 2.2.8 免疫荧光技术 | 第32-33页 |
| 2.2.9 细胞的培养与冻存 | 第33页 |
| 2.2.10 蛋白质免疫印迹技术 | 第33-34页 |
| 2.2.11 酵母双杂交筛选互作蛋白 | 第34-35页 |
| 2.2.12 His-Tag蛋白原核表达 | 第35-36页 |
| 2.2.13 GST-Tag蛋白原核表达 | 第36-37页 |
| 2.2.14 稳定细胞系建立 | 第37-38页 |
| 2.2.15 RNA干扰技术 | 第38-39页 |
| 3 结果与讨论 | 第39-64页 |
| 3.1 溶酶体蛋白TMEPAI泛素化 | 第39-47页 |
| 3.1.1 溶酶体蛋白TMEPAI体外泛素化 | 第39-43页 |
| 3.1.2 溶酶体蛋白TMEPAI体内泛素化 | 第43-45页 |
| 3.1.3 溶酶体蛋白TMEPAI泛素化修饰对其在细胞中定位的影响 | 第45-47页 |
| 3.2 泛素结合蛋白对溶酶体蛋白TMEPAI在细胞中运输的影响 | 第47-52页 |
| 3.2.1 泛素结合蛋白基因克隆与重组质粒的构建 | 第47-49页 |
| 3.2.2 酵母双杂交技术筛选TMEPAI互作蛋白 | 第49-50页 |
| 3.2.3 泛素结合蛋白HGS、STAM与TMEPAI部分共定位 | 第50-51页 |
| 3.2.4 RNA干扰HGS表达对TMEPAI影响 | 第51-52页 |
| 3.2.5 小结 | 第52页 |
| 3.3 鉴定溶酶体蛋白TMEPAI与Nedd4互作结构域 | 第52-56页 |
| 3.3.1 重组质粒pGEX-4T-2-Nedd4-WW的构建 | 第52-54页 |
| 3.3.2 GST及GST-Tag融合蛋白大肠杆菌表达及纯化 | 第54-56页 |
| 3.3.3 GST pull-down鉴定TMEPAI与Nedd4互作结构域 | 第56页 |
| 3.4 TMEPAI-Nedd4蛋白复合物形成与分离纯化 | 第56-60页 |
| 3.4.1 GST-(WW2-WW4)融合蛋白表达与纯化 | 第56-58页 |
| 3.4.2 TMEPAI-Nedd4蛋白复合物形成 | 第58-59页 |
| 3.4.3 TMEPAI-Nedd4蛋白复合物分离纯化 | 第59-60页 |
| 3.5 TMEPAI与人源Nedd4家族蛋白及Rsp5蛋白互作分析 | 第60-64页 |
| 3.5.1 人源Nedd4家族蛋白和酵母Rsp5基因重组质粒构建 | 第60-62页 |
| 3.5.2 酵母双杂交技术验证TMEPAI与其余Nedd4家族及Rsp5互作 | 第62-63页 |
| 3.5.3 小结 | 第63-64页 |
| 4 结论 | 第64-65页 |
| 5 展望 | 第65-66页 |
| 6 参考文献 | 第66-72页 |
| 7 攻读硕士学位期间发表论文情况 | 第72-73页 |
| 8 致谢 | 第73页 |
