| 摘要 | 第3-4页 |
| ABSTRACT | 第4页 |
| 第1章 前言 | 第7-13页 |
| 1.1 帕金森病与多巴胺能神经元 | 第7-11页 |
| 1.2 CRISPR/Cas基因编辑系统与多巴胺能神经元的标记 | 第11-13页 |
| 第2章 实验材料 | 第13-19页 |
| 2.1 实验设备、材料及试剂 | 第13-16页 |
| 2.1.1 实验设备 | 第13-14页 |
| 2.1.2 实验试剂与耗材 | 第14-16页 |
| 2.1.3 抗体总表 | 第16页 |
| 2.2 引物序列 | 第16-17页 |
| 2.2.1 引物设计与合成 | 第16页 |
| 2.2.2 引物列表 | 第16-17页 |
| 2.3 质粒及载体信息 | 第17-18页 |
| 2.4 细胞来源 | 第18-19页 |
| 第3章 实验方法 | 第19-36页 |
| 3.1 细胞培养冻存与复苏 | 第19-25页 |
| 3.1.1 293FT细胞培养冻存与复苏 | 第19页 |
| 3.1.2 hESC饲养层细胞的制备 | 第19-21页 |
| 3.1.3 hES细胞的复苏 | 第21-22页 |
| 3.1.4 hESC的无饲养层条件培养 | 第22-25页 |
| 3.2 基因组DNA及质粒DNA提取 | 第25页 |
| 3.3 CRISPR/Cas9n标记载体系统的构建 | 第25-28页 |
| 3.3.1 Cas9n打靶载体构建 | 第25-26页 |
| 3.3.2 同源重组Donor载体构建 | 第26-28页 |
| 3.4 细胞转染及筛选 | 第28-33页 |
| 3.4.1 HEK293FT细胞转染 | 第28-30页 |
| 3.4.2 hES细胞转染 | 第30-31页 |
| 3.4.3 细胞基因型鉴定 | 第31-33页 |
| 3.5 评估突变效率 | 第33页 |
| 3.6 hESC向DP神经元的诱导分化 | 第33-35页 |
| 3.6.1 hESC分化为神经前体干细胞 | 第33-34页 |
| 3.6.2 诱导DP神经元分化 | 第34-35页 |
| 3.7 细胞免疫染色 | 第35-36页 |
| 第4章 结果与分析 | 第36-54页 |
| 4.1 无饲养层培养的hESC干性鉴定 | 第36-37页 |
| 4.2 CRISPR/Cas9n标记载体系统的构建 | 第37-43页 |
| 4.2.1 Cas9n打靶载体的构建 | 第37-39页 |
| 4.2.2 同源重组Donor载体的构建 | 第39-43页 |
| 4.3 CRISPR/Cas9n标记系统在HEK293FT细胞中的验证 | 第43-46页 |
| 4.3.1 CRISPR/Cas9n系统Indel效率验证 | 第43-44页 |
| 4.3.2 CRISPR/Cas9n系统HDR有效性验证 | 第44-46页 |
| 4.4 CRISPR/Cas9n标记系统建立携带DP神经元特异性启动子的hES细胞系 | 第46-50页 |
| 4.4.1 携带EF1α-ZsGreen外源基因的hES细胞系建立 | 第46-48页 |
| 4.4.2 携带TH-ZsGreen外源基因的hES细胞系建立 | 第48-50页 |
| 4.5 实现DP神经元的特异性标记 | 第50-54页 |
| 4.5.1 诱导向NSC的分化 | 第50-52页 |
| 4.5.2 DP神经元的特异性标记 | 第52-54页 |
| 第5章 讨论 | 第54-57页 |
| 5.1 结果与讨论 | 第54-55页 |
| 5.2 问题与展望 | 第55-57页 |
| 致谢 | 第57-58页 |
| 参考文献 | 第58-62页 |
