| 摘要 | 第5-6页 |
| ABSTRACT | 第6页 |
| 第1章 绪论 | 第10-60页 |
| 1.1 前言 | 第10页 |
| 1.2 毕赤酵母表达系统概述 | 第10-37页 |
| 1.2.1 重组毕赤酵母技术 | 第10-14页 |
| 1.2.2 外源基因表达策略 | 第14-15页 |
| 1.2.3 启动子 | 第15-21页 |
| 1.2.4 分泌信号肽 | 第21-23页 |
| 1.2.5 表达载体 | 第23-25页 |
| 1.2.6 毕赤酵母菌株 | 第25-31页 |
| 1.2.7 毕赤酵母发酵技术 | 第31-34页 |
| 1.2.8 发酵参数优化 | 第34-37页 |
| 1.3 折叠分泌通路与内质网压力(ER stress) | 第37-60页 |
| 1.3.1 折叠分泌通路 | 第37-39页 |
| 1.3.2 内质网压力 | 第39页 |
| 1.3.3 内质网压力与疾病模型 | 第39-41页 |
| 1.3.4 Unfolded Protein Response(UPR) | 第41-45页 |
| 1.3.5 内质网相关蛋白降解(ERAD) | 第45-49页 |
| 1.3.6 细胞自噬(Autophagy) | 第49-60页 |
| 第2章 实验材料和方法 | 第60-77页 |
| 2.1 实验材料 | 第60-63页 |
| 2.1.1 抗体 | 第60页 |
| 2.1.2 化学试剂 | 第60页 |
| 2.1.3 质粒与菌株 | 第60页 |
| 2.1.4 质粒构建相关试剂 | 第60-61页 |
| 2.1.5 大肠杆菌和毕赤酵母培养基配方 | 第61页 |
| 2.1.6 Western blotting相关试剂 | 第61-62页 |
| 2.1.7 大肠杆菌感受态制备相关试剂 | 第62页 |
| 2.1.8 引物(质粒构建) | 第62页 |
| 2.1.9 考马斯染色相关试剂 | 第62-63页 |
| 2.1.10 其他试剂配方 | 第63页 |
| 2.1.11 仪器设备 | 第63页 |
| 2.2 实验方法 | 第63-77页 |
| 2.2.1 毕赤酵母细胞全蛋白的抽提 | 第63-64页 |
| 2.2.2 Western blotting | 第64-65页 |
| 2.2.3 酵母全基因组DNA的抽提 | 第65-66页 |
| 2.2.4 酵母RNA抽提(热酚法) | 第66页 |
| 2.2.5 逆转录反应 | 第66-67页 |
| 2.2.6 实时荧光定量PCR | 第67页 |
| 2.2.7 ELISA | 第67-68页 |
| 2.2.8 糖苷酶F处理 | 第68页 |
| 2.2.9 Ni亲和胶纯化 | 第68页 |
| 2.2.10 大肠杆菌感受态的制备 | 第68-69页 |
| 2.2.11 质粒抽提 | 第69-70页 |
| 2.2.12 DNA片段纯化回收(构建质粒) | 第70-71页 |
| 2.2.13 PCR | 第71-72页 |
| 2.2.14 酵母细胞样本的流式检测 | 第72页 |
| 2.2.15 酵母细胞的荧光显微镜观察 | 第72页 |
| 2.2.16 酵母细胞的超薄透射电镜样品制备流程 | 第72-73页 |
| 2.2.17 质粒电转化毕赤酵母 | 第73-75页 |
| 2.2.18 荧光定量PCR检测阳性转化子拷贝数 | 第75-76页 |
| 2.2.19 阳性转化子的蛋白表达鉴定 | 第76-77页 |
| 第3章 实验结果 | 第77-89页 |
| 3.1 构建重组人IL-10表达质粒rhIL-10/pPIC9k | 第77-78页 |
| 3.1.1 PCR扩增α-factor片段 | 第77页 |
| 3.1.2 PCR扩增rhIL-10片段 | 第77页 |
| 3.1.3 重叠延伸PCR连接a-factor片段和rhIL-10片段 | 第77页 |
| 3.1.4 α-factor-rhIL-10与pPIC9k质粒的连接,转化和筛选鉴定 | 第77-78页 |
| 3.2 鉴定和筛选表达rhIL-10的毕赤酵母菌株 | 第78-79页 |
| 3.2.1 基因组PCR鉴定阳性转化克隆 | 第78页 |
| 3.2.2 Western blotting鉴定rhIL-10表达克隆 | 第78页 |
| 3.2.3 ELISA筛选高效表达rhIL-10的克隆 | 第78-79页 |
| 3.2.4 鉴定表达质粒的拷贝数 | 第79页 |
| 3.3 探究低温培养提高rhIL-10蛋白产量的机制 | 第79-81页 |
| 3.3.1 优化rhIL-10表达菌株的培养温度 | 第80-81页 |
| 3.4 培养温度影响毕赤酵母的内质网压力水平 | 第81-83页 |
| 3.5 培养温度影响毕赤酵母细胞的活力 | 第83-85页 |
| 3.6 培养温度影响Unfolded Protein Response(UPR) | 第85-86页 |
| 3.7 培养温度对ERAD的影响 | 第86-87页 |
| 3.8 培养温度对细胞自噬(autophagy)的影响 | 第87-89页 |
| 3.8.1 培养温度影响rhIL-10表达酵母的细胞自噬(mRNA水平) | 第87页 |
| 3.8.2 培养温度影响rhIL-10表达酵母的内质网自噬(ER-phagy) | 第87-89页 |
| 第4章 讨论 | 第89-93页 |
| 4.1 重组人白细胞介素-10制备工艺的现状 | 第89页 |
| 4.2 低温缓解内质网压力 | 第89-91页 |
| 4.3 创新点 | 第91-92页 |
| 4.4 不足与展望 | 第92-93页 |
| 参考文献 | 第93-102页 |
| 附录1 人IL-10表达序列 | 第102-103页 |
| 附录2 RT-qPCR引物列表 | 第103-104页 |
| 致谢 | 第104-105页 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果 | 第105-106页 |
