| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 第1章 文献综述 | 第12-48页 |
| 1.1 酶工程及其面临的主要问题 | 第12-13页 |
| 1.2 肝素类药物的重要性 | 第13-17页 |
| 1.3 肝素 | 第17-22页 |
| 1.3.1 肝素的结构 | 第17-19页 |
| 1.3.2 肝素的抗凝血机理 | 第19-21页 |
| 1.3.3 肝素的副作用 | 第21-22页 |
| 1.4 低分子量肝素 | 第22-26页 |
| 1.4.1 低分子量肝素概况 | 第22-23页 |
| 1.4.2 低分子量肝素的制备工艺 | 第23-26页 |
| 1.5 超低分子量肝素 | 第26-27页 |
| 1.6 肝素酶 | 第27-34页 |
| 1.6.1 肝素酶概况 | 第27-29页 |
| 1.6.2 肝素酶用途 | 第29-30页 |
| 1.6.3 肝素酶I 结构 | 第30-32页 |
| 1.6.4 肝素酶I 活性检测方法 | 第32-33页 |
| 1.6.5 肝素酶I 异源表达研究进展 | 第33-34页 |
| 1.7 肝素酶I 制备低分子量肝素工艺中存在的主要问题 | 第34-35页 |
| 1.8 融合蛋白技术及连接肽 | 第35-36页 |
| 1.9 融合标签 | 第36-44页 |
| 1.9.1 绿色荧光蛋白（GFP） | 第38-40页 |
| 1.9.2 红色荧光蛋白（RFP） | 第40-42页 |
| 1.9.3 麦芽糖结合蛋白（MBP） | 第42-44页 |
| 1.10 本论文的研究意义和立题思想 | 第44-46页 |
| 1.11 本论文的研究内容与框架 | 第46-48页 |
| 1.11.1 本论文的主要研究内容 | 第46页 |
| 1.11.2 本论文研究框架 | 第46-48页 |
| 第2章 荧光蛋白与肝素酶双重融合体系的构建与特性分析 | 第48-72页 |
| 2.1 引言 | 第48-49页 |
| 2.2 实验材料与方法 | 第49-57页 |
| 2.2.1 菌株及质粒 | 第49-51页 |
| 2.2.2 培养基 | 第51页 |
| 2.2.3 重组质粒的构建及转化 | 第51-54页 |
| 2.2.4 菌体的培养及目标蛋白的诱导 | 第54页 |
| 2.2.5 肝素酶酶活测定方法 | 第54-55页 |
| 2.2.6 His-tag 蛋白纯化方法 | 第55页 |
| 2.2.7 蛋白浓度检测 | 第55-56页 |
| 2.2.8 SDS-PAGE 蛋白质变性凝胶电泳 | 第56页 |
| 2.2.9 荧光强度检测 | 第56-57页 |
| 2.2.10 热稳定性评价 | 第57页 |
| 2.3 荧光蛋白与肝素酶双重融合质粒的宿主优化 | 第57-61页 |
| 2.4 荧光蛋白与肝素酶双重融合蛋白的追踪培养 | 第61-66页 |
| 2.4.1 酶活、荧光强度、菌浓变化 | 第61-65页 |
| 2.4.2 GFP 融合与RFP 融合体系特征比较 | 第65-66页 |
| 2.5 荧光蛋白与肝素酶双重融合酶的纯化比较 | 第66-69页 |
| 2.6 荧光蛋白与肝素酶双重融合酶的热稳定性比较 | 第69-70页 |
| 2.7 本章小结 | 第70-72页 |
| 第3章 三重融合蛋白GFP-MBP-HepA 的构建与特性分析 | 第72-90页 |
| 3.1 引言 | 第72-73页 |
| 3.2 实验材料与方法 | 第73-78页 |
| 3.2.1 菌株及质粒 | 第73-75页 |
| 3.2.2 培养基 | 第75页 |
| 3.2.3 重组质粒的构建及转化 | 第75-77页 |
| 3.2.4 MBP-tag 蛋白纯化方法 | 第77-78页 |
| 3.2.5 其他方法 | 第78页 |
| 3.3 GFP-MBP-HepA 三重融合表达体系初探 | 第78-79页 |
| 3.4 His_6-GFP-MBP-HepA 表达质粒的宿主优化 | 第79-82页 |
| 3.5 His_6-GFP-MBP-HepA 三重融合体系的荧光定量追踪 | 第82-85页 |
| 3.5.1 荧光定量追踪 | 第82-85页 |
| 3.5.2 菌体生长 | 第85页 |
| 3.6 His_6-GFP-MBP-HepA 三重融合体系的纯化 | 第85-87页 |
| 3.7 His_6-GFP-MBP-HepA 三重融合体系的热稳定性比较 | 第87-88页 |
| 3.8 本章小结 | 第88-90页 |
| 第4章 三重融合蛋白MBP-GFP-HepA 的构建与特性分析 | 第90-106页 |
| 4.1 引言 | 第90页 |
| 4.2 实验材料与方法 | 第90-96页 |
| 4.2.1 菌株及质粒 | 第90-93页 |
| 4.2.2 培养基 | 第93页 |
| 4.2.3 重组质粒的构建及转化 | 第93-96页 |
| 4.2.4 其他方法 | 第96页 |
| 4.3 MBP-GFP-HepA 三重融合表达体系初探 | 第96-97页 |
| 4.4 His_6-MBP-GFP-HepA 三重融合构建策略 | 第97-98页 |
| 4.5 His_6-MBP-GFP-HepA 三重融合体系的纯化 | 第98-101页 |
| 4.6 His_6-MBP-GFP-HepA 三重融合体系的热稳定性比较 | 第101-102页 |
| 4.7 三重融合体系的比较小结 | 第102-105页 |
| 4.8 本章小结 | 第105-106页 |
| 第5章 连接肽设计对融合蛋白的影响机理 | 第106-125页 |
| 5.1 引言 | 第106页 |
| 5.2 实验材料与方法 | 第106-110页 |
| 5.2.1 菌株及质粒 | 第106-108页 |
| 5.2.2 连接肽序列 | 第108页 |
| 5.2.3 培养基 | 第108页 |
| 5.2.4 酶学性质测定 | 第108-109页 |
| 5.2.5 MBP 亲和常数测定 | 第109-110页 |
| 5.2.6 其他方法 | 第110页 |
| 5.3 连接肽长度对融合蛋白功能的影响 | 第110-114页 |
| 5.4 连接肽刚柔度对融合蛋白功能的影响 | 第114-122页 |
| 5.4.1 连接肽刚柔度对MBP 亲和性的影响 | 第115-118页 |
| 5.4.2 连接肽刚柔度对HepA 酶学特性的影响 | 第118-121页 |
| 5.4.3 连接肽刚柔度对融合酶热稳定性的影响 | 第121-122页 |
| 5.5 多功能化融合蛋白构建小结 | 第122-123页 |
| 5.6 本章小结 | 第123-125页 |
| 第6章 融合肝素酶在低分子量肝素生产工艺中的应用 | 第125-152页 |
| 6.1 引言 | 第125-126页 |
| 6.2 实验材料与方法 | 第126-132页 |
| 6.2.1 菌株及质粒 | 第126页 |
| 6.2.2 培养基 | 第126页 |
| 6.2.3 肝素酶酶活测定方法 | 第126页 |
| 6.2.4 DNS 法测定葡萄糖浓度 | 第126-127页 |
| 6.2.5 融合酶的发酵生产 | 第127-128页 |
| 6.2.6 融合酶的保存及活性追踪 | 第128页 |
| 6.2.7 LMWH 酶法制备工艺 | 第128-129页 |
| 6.2.8 LMWH 的分子量测定 | 第129-131页 |
| 6.2.9 LMWH 的抗Xa、IIa 因子活性检测 | 第131-132页 |
| 6.3 融合酶的发酵生产 | 第132-133页 |
| 6.4 融合酶的保存 | 第133-134页 |
| 6.5 酶量与反应速度的关系 | 第134-136页 |
| 6.6 LMWH 制备工艺条件优化 | 第136-138页 |
| 6.6.1 Ca~(2+)浓度 | 第136页 |
| 6.6.2 NaCl 浓度 | 第136-137页 |
| 6.6.3 pH 值 | 第137-138页 |
| 6.6.4 反应温度 | 第138页 |
| 6.7 酶法制备LMWH 反应特征分析 | 第138-142页 |
| 6.8 LMWH 制备工艺产品分子量预测 | 第142-143页 |
| 6.9 LMWH 产品评价 | 第143-146页 |
| 6.10 LMWH 制备工艺产率影响因素 | 第146-147页 |
| 6.11 LMWH 制备工艺运行成本核算及分析 | 第147-150页 |
| 6.11.1 酶生产运行成本 | 第147-149页 |
| 6.11.2 酶催化运行成本 | 第149-150页 |
| 6.12 本章小结 | 第150-152页 |
| 第7章 结论与展望 | 第152-156页 |
| 7.1 本论文结论 | 第152-155页 |
| 7.2 本论文创新点 | 第155页 |
| 7.3 本论文展望 | 第155-156页 |
| 参考文献 | 第156-165页 |
| 致谢 | 第165-166页 |
| 附录A 主要实验仪器及试剂 | 第166-169页 |
| 附录B 胶密度扫描准确性验证 | 第169-170页 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果 | 第170-172页 |
