| 摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 缩略词 | 第8-14页 |
| 第一章 文献综述 | 第14-55页 |
| 1.1 RNA沉默研究进展 | 第14-32页 |
| 1.1.1 RNA沉默的基本过程 | 第14-15页 |
| 1.1.2 RNA沉默通路中的关键因子 | 第15-21页 |
| 1.1.3 RNA沉默的主要通路 | 第21-28页 |
| 1.1.4 抗病毒RNA沉默 | 第28-32页 |
| 1.2 RNA沉默抑制子研究进展 | 第32-39页 |
| 1.2.1 病毒RNA沉默抑制子的作用机制 | 第33-37页 |
| 1.2.2 其他抗病毒机制及其与RNA沉默的关系 | 第37-39页 |
| 1.3 马铃薯卷叶属病毒及其P0蛋白研究进展 | 第39-49页 |
| 1.3.1 马铃薯卷叶属病毒 | 第39-41页 |
| 1.3.2 马铃薯卷叶属P0蛋白研究进展 | 第41-49页 |
| 1.4 香石竹潜隐病毒属病毒及其富半胱氨酸蛋白研究进展 | 第49-53页 |
| 1.4.1 香石竹潜隐病毒属病毒研究进展 | 第49-52页 |
| 1.4.2 Carlavirus病毒CRP蛋白研究进展 | 第52-53页 |
| 1.5 本论文研究目的与意义 | 第53-55页 |
| 第二章 基本实验材料与方法 | 第55-85页 |
| 2.1 实验材料 | 第55-57页 |
| 2.1.1 植物材料 | 第55页 |
| 2.1.2 菌种 | 第55页 |
| 2.1.3 载体和基因 | 第55-56页 |
| 2.1.4 毒源和抗血清 | 第56页 |
| 2.1.5 酶和化学试剂 | 第56-57页 |
| 2.1.6 引物合成和DNA测序 | 第57页 |
| 2.2 试剂、溶液和培养基的配制 | 第57-63页 |
| 2.2.1 常用试剂、溶液和培养基 | 第57-59页 |
| 2.2.2 具体实验所用试剂、溶液和培养基 | 第59-63页 |
| 2.3 实验方法 | 第63-85页 |
| 2.3.1 PCR(聚合酶链式反应) | 第63-64页 |
| 2.3.2 DNA片段的回收和加dA反应 | 第64-65页 |
| 2.3.3 DNA片段与载体的连接 | 第65页 |
| 2.3.4 大肠杆菌感受态细胞制备与转化 | 第65-66页 |
| 2.3.5 重组质粒的快速筛选 | 第66页 |
| 2.3.6 质粒DNA的小量提取和酶切鉴定 | 第66页 |
| 2.3.7 农杆菌感受态细胞的制备和转化 | 第66-67页 |
| 2.3.8 农杆菌浸润法介导的瞬时表达 | 第67页 |
| 2.3.9 长波紫外灯下观察与拍摄 | 第67页 |
| 2.3.10 Western blot检测 | 第67-68页 |
| 2.3.11 植物总RNA的提取(Trizol法) | 第68页 |
| 2.3.12 Northern blot(大分子量RNA的检测) | 第68-69页 |
| 2.3.13 Northern blot(小分子量RNA的检测) | 第69-71页 |
| 2.3.14 反转录及Real-time PCR分析 | 第71-72页 |
| 2.3.15 双链RNA切割实验(dsRNA cleavage assay) | 第72-73页 |
| 2.3.16 β-elimination实验 | 第73页 |
| 2.3.17 蛋白的原核表达与纯化 | 第73-76页 |
| 2.3.18 电泳迁移率实验 | 第76-77页 |
| 2.3.19 本生烟叶片细胞质和细胞核的分离提取 | 第77-78页 |
| 2.3.20 激光共聚焦显微镜观察 | 第78页 |
| 2.3.21 免疫共沉淀实验(co-immunoprecipitation,co-IP) | 第78-79页 |
| 2.3.22 二甲基联苯胺(Diaminobenzidin,DAB)染色 | 第79页 |
| 2.3.23 水杨酸(salicylic acid,SA)喷施处理 | 第79页 |
| 2.3.24 酵母双杂交cDNA文库筛选(共转化法) | 第79-80页 |
| 2.3.25 酵母双杂交实验 | 第80-81页 |
| 2.3.26 植物总RNA的提取(LiCl沉淀法) | 第81页 |
| 2.3.27 反转录PCR(RT-PCR) | 第81页 |
| 2.3.28 5'Rapid Amplification of cDNA Ends (5'RACE) | 第81-83页 |
| 2.3.29 序列分析、多重序列比对及进化树构建 | 第83-84页 |
| 2.3.30 植物病毒粗提纯 | 第84页 |
| 2.3.31 植物病毒的负染和电镜观察 | 第84页 |
| 2.3.32 植物病毒的接种 | 第84-85页 |
| 第三章 BrYV-A P0蛋白及其突变体的RNA沉默抑制功能分析 | 第85-96页 |
| 3.1 BrYV-A P0蛋白及其突变体的沉默抑制功能分析 | 第85-91页 |
| 3.1.1 表达载体的构建 | 第86页 |
| 3.1.2 BrYV-A P0蛋白及其突变体的局部沉默抑制功能研究 | 第86-90页 |
| 3.1.3 BrYV-A P0蛋白及其突变体的系统沉默抑制功能研究 | 第90-91页 |
| 3.2 BrYV-A P0及其突变体对siRNA积累量的影响 | 第91-93页 |
| 3.2.1 BrYV-A P0及其突变体对siRNA积累量的影响 | 第91页 |
| 3.2.2 BrYV-A P0蛋白及其突变体对次级siRNA积累量的影响 | 第91-92页 |
| 3.2.3 BrYV-A P0蛋白及其突变体对初级siRNA积累量的影响 | 第92-93页 |
| 3.3 本章小结与讨论 | 第93-96页 |
| 3.3.1 BrYV-A P0蛋白RNA沉默抑制特性的分析和探讨 | 第94页 |
| 3.3.2 BrYV-A P0蛋白各突变体RNA沉默抑制特性的分析和探讨 | 第94-96页 |
| 第四章 BrYV-A P0蛋白RNA沉默抑制机制的探索 | 第96-120页 |
| 4.1 BrYV-A PO蛋白及其突变体对AGO1的降解作用研究 | 第96-98页 |
| 4.2 BrYV-A P0蛋白抑制初级siRNA积累的机制研究 | 第98-105页 |
| 4.2.1 载体构建 | 第98页 |
| 4.2.2 BrYV-A P0蛋白对DCL转录水平的影响 | 第98-99页 |
| 4.2.3 BrYV-A P0蛋白对植物DCL蛋白双链RNA切割活性的影响 | 第99-102页 |
| 4.2.4 BrYV-A P0蛋白对siRNA甲基化的影响 | 第102-103页 |
| 4.2.5 BrYV-A P0蛋白的dsRNA结合能力研究 | 第103-105页 |
| 4.3 BrYV-A P0蛋白的亚细胞定位研究 | 第105-112页 |
| 4.3.1 定位载体的构建 | 第105-106页 |
| 4.3.2 BrYV-A P0蛋白主要存在于本生烟的细胞质组分中 | 第106-107页 |
| 4.3.3 融合蛋白P0~(BrA)-GFP在植物细胞中的定位 | 第107-112页 |
| 4.4 BrYV-A P0蛋白与RDR6/SGS3之间的关系研究 | 第112-116页 |
| 4.4.1 载体构建 | 第112页 |
| 4.4.2 BrYV-A P0蛋白对RDR6/SGS3蛋白积累量的影响 | 第112-113页 |
| 4.4.3 BrYV-A P0蛋白与RDR6/SGS3蛋白的互作研究 | 第113-114页 |
| 4.4.4 BrYV-A P0蛋白对tasiRNA生物合成的影响 | 第114-116页 |
| 4.5 本章小结与讨论 | 第116-120页 |
| 4.5.1 BrYV-A P0蛋白介导AGO1降解与其RNA沉默抑制能力的关系 | 第116-117页 |
| 4.5.2 BrYV-A P0蛋白抑制初级siRNA积累的机制探索 | 第117-119页 |
| 4.5.3 BrYV-A P0蛋白与RDR6/SGS3的关系 | 第119-120页 |
| 第五章 BrYV-A P0蛋白所致坏死的研究及其互作蛋白的筛选 | 第120-130页 |
| 5.1 BrYV-A PO蛋白及其突变体所致坏死反应的特征 | 第120-124页 |
| 5.1.1 表达载体的构建 | 第120页 |
| 5.1.2 BrYV-A P0蛋白所致坏死伴随活性氧的产生和PR1基因的上调 | 第120-122页 |
| 5.1.3 水杨酸处理能延迟BrYV-A PO蛋白在木生烟上诱发的坏死 | 第122-124页 |
| 5.2 与BrYV-A P0蛋白互作的寄主蛋白的筛选 | 第124-127页 |
| 5.2.1 载体构建 | 第124页 |
| 5.2.2 酵母双杂交系统对拟南芥cDNA文库进行P0~(BrA)互作蛋白筛选 | 第124-126页 |
| 5.2.3 利用免疫沉淀法结合质谱分析筛选与P0~(BrA)互作的本生烟蛋白 | 第126-127页 |
| 5.3 本章小结与讨论 | 第127-130页 |
| 5.3.1 BrYV-A P0所致坏死反应的特性及与RNA沉默抑制功能的关系 | 第127-128页 |
| 5.3.2 与BrYV-A P0互作的寄主蛋白筛选结果分析 | 第128-130页 |
| 第六章 一种侵染马铃薯的Carlavirus新病毒的分子鉴定和CRP蛋白的功能分析 | 第130-147页 |
| 6.1 Potato virus H全长基因组cDNA的克隆测序和亲缘关系分析 | 第130-135页 |
| 6.1.1 载体构建 | 第130-131页 |
| 6.1.2 PVH病毒全长基因组序列测定、5'RACE和基因组结构预测 | 第131-133页 |
| 6.1.3 与Carlavirus病毒之间的序列一致性分析和系统进化分析 | 第133-135页 |
| 6.2 Potato virus H的生物学特征分析 | 第135-142页 |
| 6.2.1 载体构建 | 第135-136页 |
| 6.2.2 PVH CP蛋白的原核表达和纯化以及抗血清的制备 | 第136-137页 |
| 6.2.3 PVH血清学关系研究 | 第137-139页 |
| 6.2.4 PVH寄主范围研究 | 第139-141页 |
| 6.2.5 病毒提纯和PVH病毒粒子形态 | 第141-142页 |
| 6.3 Potato virus H富半胱氨酸蛋白生物学功能分析 | 第142-145页 |
| 6.3.1 载体构建 | 第142-143页 |
| 6.3.2 富半胱氨酸蛋白的生物学功能 | 第143-145页 |
| 6.4 本章小结与讨论 | 第145-147页 |
| 第七章 结论与展望 | 第147-149页 |
| 7.1 结论 | 第147-148页 |
| 7.2 展望 | 第148-149页 |
| 参考文献 | 第149-177页 |
| 附录Ⅰ 引物列表 | 第177-181页 |
| 附录Ⅱ RNA序列 | 第181-182页 |
| 致谢及基金 | 第182-185页 |
| 个人简历 | 第185-186页 |
