| 致谢 | 第5-6页 |
| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 第一章 绪论 | 第14-30页 |
| 1.1 葡萄糖脱氢酶 | 第14-22页 |
| 1.1.1 简介 | 第14-15页 |
| 1.1.2 PQQ-GDH | 第15-17页 |
| 1.1.3 sPQQGDH的应用 | 第17-19页 |
| 1.1.4 研究现状 | 第19-22页 |
| 1.2 大肠杆菌重组表达系统 | 第22-25页 |
| 1.2.1 大肠杆菌表达系统的组成 | 第22页 |
| 1.2.2 影响外源基因在大肠杆菌系统中表达的因素 | 第22-24页 |
| 1.2.3 pET表达系统 | 第24-25页 |
| 1.3 酶分子定向进化 | 第25-29页 |
| 1.3.1 简介 | 第25-26页 |
| 1.3.2 定向进化中构建文库的常用方法 | 第26-28页 |
| 1.3.3 突变体文库筛选技术 | 第28-29页 |
| 1.4 本课题的基本思路和拟研究内容 | 第29-30页 |
| 第二章 材料与方法 | 第30-36页 |
| 2.1 菌株和质粒 | 第30页 |
| 2.2 主要仪器与试剂 | 第30-32页 |
| 2.2.1 工具酶与主要试剂 | 第30-31页 |
| 2.2.2 主要仪器与设备 | 第31-32页 |
| 2.3 分子生物学相关操作 | 第32-33页 |
| 2.3.1 大肠杆菌质粒的提取 | 第32页 |
| 2.3.2 凝胶回收纯化DNA | 第32页 |
| 2.3.3 感受态细胞的制备 | 第32页 |
| 2.3.4 转化大肠杆菌感受态细胞 | 第32-33页 |
| 2.4 大肠杆菌菌体浓度测定 | 第33页 |
| 2.5 SDS-PAGE蛋白电泳 | 第33页 |
| 2.6 蛋白浓度测定 | 第33页 |
| 2.7 sPQQGDH酶活测定 | 第33-36页 |
| 2.7.1 sPQQGDH全酶形成 | 第33-34页 |
| 2.7.2 酶活测定 | 第34-36页 |
| 第三章 sPQQGDH在大肠杆菌中的重组表达与优化 | 第36-56页 |
| 3.1 引言 | 第36-37页 |
| 3.2 材料与方法 | 第37-42页 |
| 3.2.1 菌株与质粒 | 第37页 |
| 3.2.2 主要仪器与试剂 | 第37页 |
| 3.2.3 分子生物学基本操作 | 第37页 |
| 3.2.4 培养基 | 第37页 |
| 3.2.5 sPQQGDH基因的克隆 | 第37-38页 |
| 3.2.6 克隆载体与表达载体的构建 | 第38-40页 |
| 3.2.7 sPQQGDH酶蛋白的表达 | 第40页 |
| 3.2.8 肠激酶酶切融合蛋白 | 第40页 |
| 3.2.9 诱导条件对sPQQGDH表达的影响 | 第40-41页 |
| 3.2.10 培养基碳源类型及浓度对sPQQGDH表达的影响 | 第41-42页 |
| 3.2.11 表达体系的放大 | 第42页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第42-55页 |
| 3.3.1 sPQQGDH基因的扩增 | 第42-43页 |
| 3.3.2 克隆载体与表达载体的构建 | 第43-44页 |
| 3.3.3 sPQQGDH的重组表达 | 第44-46页 |
| 3.3.4 诱导条件对sPQQGDH表达的影响 | 第46-49页 |
| 3.3.5 碳源种类对sPQQGDH产量的影响 | 第49-51页 |
| 3.3.6 葡萄糖浓度对sPQQGDH产量的影响 | 第51-52页 |
| 3.3.7 培养时间对sPQQGDH表达的影响 | 第52-54页 |
| 3.3.8 表达体系的放大 | 第54-55页 |
| 3.4 小结 | 第55-56页 |
| 第四章 sPQQGDH的纯化与性质测定 | 第56-68页 |
| 4.1 引言 | 第56页 |
| 4.2 材料与方法 | 第56-60页 |
| 4.2.1 菌种 | 第56页 |
| 4.2.2 试剂与溶液 | 第56-57页 |
| 4.2.3 样品处理 | 第57页 |
| 4.2.4 亲和层析纯化 | 第57-58页 |
| 4.2.5 超滤除盐 | 第58页 |
| 4.2.6 蛋白浓度与酶活测定 | 第58页 |
| 4.2.7 动力学参数测定 | 第58-59页 |
| 4.2.8 热稳定性测定 | 第59页 |
| 4.2.9 底物专一性测定 | 第59页 |
| 4.2.10 对酶保护剂提高酶稳定性的分析 | 第59-60页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第60-66页 |
| 4.3.1 亲和层析 | 第60-62页 |
| 4.3.2 动力学参数测定 | 第62-63页 |
| 4.3.3 热稳定性分析 | 第63-64页 |
| 4.3.4 底物专一性 | 第64页 |
| 4.3.5 酶稳定保护剂的保护作用 | 第64-66页 |
| 4.4 小结 | 第66-68页 |
| 第五章 sPQQGDH定向进化提高热稳定性 | 第68-84页 |
| 5.1 引言 | 第68-69页 |
| 5.2 材料与方法 | 第69-75页 |
| 5.2.1 菌株与质粒 | 第69页 |
| 5.2.2 主要试剂与仪器 | 第69页 |
| 5.2.3 分子生物学操作方法 | 第69页 |
| 5.2.4 培养基 | 第69页 |
| 5.2.5 制备高效大肠杆菌电转化感受态 | 第69-70页 |
| 5.2.6 电转化 | 第70页 |
| 5.2.7 易错PCR | 第70-71页 |
| 5.2.8 构建突变文库 | 第71页 |
| 5.2.9 高通量筛选突变文库 | 第71-74页 |
| 5.2.10 定点突变 | 第74页 |
| 5.2.11 纯化与酶学性质 | 第74-75页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第75-83页 |
| 5.3.1 制备高效大肠杆菌电转化感受态 | 第75-76页 |
| 5.3.2 易错PCR | 第76页 |
| 5.3.3 构建高容量突变文库 | 第76-77页 |
| 5.3.4 高通量筛选突变文库 | 第77-79页 |
| 5.3.5 定点突变 | 第79页 |
| 5.3.6 热稳定性分析 | 第79-80页 |
| 5.3.7 耐热机制分析 | 第80-82页 |
| 5.3.8 其他酶学性质分析 | 第82-83页 |
| 5.4 小结 | 第83-84页 |
| 第六章 结论与展望 | 第84-87页 |
| 6.1 结论 | 第84-85页 |
| 6.2 展望 | 第85-87页 |
| 参与文献 | 第87-98页 |
| 作者简历 | 第98页 |
