| 摘要 | 第4-7页 |
| Abstract | 第7-9页 |
| 目录 | 第11-16页 |
| 缩略词 | 第16-18页 |
| 第一章 文献综述 | 第18-35页 |
| 1 植物转录因子研究进展 | 第18-22页 |
| 1.1 转录因子的概念、结构与功能 | 第18页 |
| 1.2 高等植物转录因子的功能结构域 | 第18-22页 |
| 1.2.1 DNA结合域 | 第19-20页 |
| 1.2.2 寡聚化位点 | 第20-21页 |
| 1.2.3 转录调控区 | 第21页 |
| 1.2.4 核定位信号 | 第21-22页 |
| 2 WRKY类转录因子的研究进展 | 第22-32页 |
| 2.1 WRKY类转录因子的结构及分类 | 第23-24页 |
| 2.2 WRKY结构域和W-盒 | 第24-25页 |
| 2.3 WRKY类转录因子的生物学功能 | 第25-32页 |
| 2.3.1 在植物防卫反应中的作用 | 第26-28页 |
| 2.3.2 在植物响应非生物胁迫中的作用 | 第28-30页 |
| 2.3.3 WRKY转录因子在植物生长发育中的调节作用 | 第30-32页 |
| 3 橡胶树遗传转化的研究进展 | 第32-33页 |
| 4 本研究背景、目的和意义 | 第33-34页 |
| 5 本研究技术路线 | 第34-35页 |
| 第二章 巴西橡胶树4个WRKY基因的分离 | 第35-92页 |
| 1 材料与方法 | 第35-48页 |
| 1.1 实验材料 | 第35页 |
| 1.2 实验方法 | 第35-48页 |
| 1.2.1 巴西橡胶树CATAS 7-33-97的低温处理 | 第35-36页 |
| 1.2.2 橡胶树总RNA的提取与质量检测 | 第36-37页 |
| 1.2.3 单链cDNA的合成 | 第37-38页 |
| 1.2.4 橡胶树WRKY基因的克隆 | 第38-42页 |
| 1.2.5 HbWRKY基因编码区的克隆 | 第42-45页 |
| 1.2.6 HbWRKY基因DNA序列全长的扩增 | 第45-46页 |
| 1.2.7 启动子区域的扩增 | 第46-48页 |
| 2 结果与分析 | 第48-89页 |
| 2.1 引物设计 | 第48-49页 |
| 2.2 四个HbWRKY基因全长序列的获得 | 第49-89页 |
| 2.2.1 HbWRKYl全长序列的克隆与功能预测 | 第49-60页 |
| 2.2.2 HbWRKY2全长序列的克隆与功能预测 | 第60-69页 |
| 2.2.3 HbWRKY3全长序列的克隆与功能预测 | 第69-78页 |
| 2.2.4 HbWRKY4全长序列的克隆与功能预测 | 第78-89页 |
| 3 讨论 | 第89-90页 |
| 3.1 橡胶树HbWRKY基因的克隆 | 第89页 |
| 3.2 HbWRKY基因的启动子分析 | 第89页 |
| 3.3 WRKY蛋白同源性和进化树分析 | 第89-90页 |
| 4 小结 | 第90-92页 |
| 第三章 橡胶树HbWRKY在儿种逆境诱导下的表达分析 | 第92-117页 |
| 1 材料与方法 | 第92-96页 |
| 1.1 材料处理 | 第92-93页 |
| 1.2 方法 | 第93-96页 |
| 1.2.1 RNA的提取 | 第93页 |
| 1.2.2 反转录cDNA第一链 | 第93页 |
| 1.2.3 实时荧光定量PCR | 第93-96页 |
| 2 结果与分析 | 第96-113页 |
| 2.1 RNA的提取 | 第96页 |
| 2.2 四个HbWRKY基因在橡胶树中组织特异性表达分析 | 第96-97页 |
| 2.3 四个橡胶树HbWRKY基因在干旱胁迫中的表达分析 | 第97-98页 |
| 2.4 四个HbWRKY基因在橡胶树中响应PEG胁迫的表达分析 | 第98-99页 |
| 2.5 四个HbWRKY基因在橡胶树中响应高盐胁迫的表达分析 | 第99-101页 |
| 2.6 HbWRKY基因在橡胶树中响应几种激素诱导的表达分析 | 第101-107页 |
| 2.6.1 HbWRKY1在几种激素诱导下的表达分析 | 第101-102页 |
| 2.6.2 HbWRKY2在几种激素诱导下的表达分析 | 第102-103页 |
| 2.6.3 HbWRKY3在几种激素诱导下的表达分析 | 第103-105页 |
| 2.6.4 HbWRKY4在几种激素诱导下的表达分析 | 第105-107页 |
| 2.7 HbWRKY基因在橡胶树中响应低温胁迫的表达分析 | 第107-113页 |
| 2.7.1 HbWRKY1在橡胶树中响应低温胁迫的表达分析 | 第107-108页 |
| 2.7.2 HbWRKY2在橡胶树中响应低温胁迫的表达分析 | 第108-110页 |
| 2.7.3 HbWRKY3在橡胶树中响应低温胁迫的表达分析 | 第110-111页 |
| 2.7.4 HbWRKY4在橡胶树中响应低温胁迫的表达分析 | 第111-113页 |
| 3 讨论 | 第113-116页 |
| 3.1 基因在不同品种中受低温胁迫的表达模式 | 第113页 |
| 3.2 低温预处理对HbWRKY基因表达的影响 | 第113-114页 |
| 3.3 HbWRKY1在不同非生物胁迫下的表达分析 | 第114页 |
| 3.4 橡胶树HbWRKY2、HbWRKY3、HbWRKY4响应非生物胁迫的表达分析 | 第114-115页 |
| 3.5 响应PEG和高盐胁迫的表达分析 | 第115-116页 |
| 4 小结 | 第116-117页 |
| 第四章 HbWRKY基因转化拟南芥及其生物学功能鉴定 | 第117-170页 |
| 1 材料与方法 | 第117-132页 |
| 1.1 实验材料 | 第117页 |
| 1.2 植物表达载体的构建、转化农杆菌 | 第117-119页 |
| 1.2.1 pXCS-HbWRKY-HAStrep表达载体的构建 | 第117-118页 |
| 1.2.2 pXCS-HbWRKY-HAStrep电击转化农杆菌GV3101 | 第118-119页 |
| 1.2.3 pCAMBIA1304-HbWRKY3载体的构建 | 第119页 |
| 1.3 农杆菌介导的拟南芥转化和筛选 | 第119-120页 |
| 1.4 HbWRKY基因转化拟南芥PCR、纯系筛选、Southern杂交 | 第120-125页 |
| 1.4.1 转基因株系PCR的鉴定 | 第120-121页 |
| 1.4.2 转基因植株的纯系筛选 | 第121页 |
| 1.4.3 转基因株系的Southern杂交 | 第121-125页 |
| 1.5 RT-PCR半定量检测 | 第125-126页 |
| 1.5.1 拟南芥RNA的提取 | 第125页 |
| 1.5.2 cDNA第一链的合成 | 第125页 |
| 1.5.3 半定量RT-PCR | 第125-126页 |
| 1.6 转基因拟南芥表型观察 | 第126-127页 |
| 1.6.1 拟南芥的培养 | 第126页 |
| 1.6.2 拟南芥非生物胁迫处理 | 第126-127页 |
| 1.7 转基因拟南芥胁迫处理和实时荧光定量表达分析 | 第127-128页 |
| 1.7.1 拟南芥的各种胁迫处理 | 第127页 |
| 1.7.2 RNA的提取、cDNA第一链合成 | 第127页 |
| 1.7.3 引物设计 | 第127-128页 |
| 1.7.4 实时荧光定量PCR | 第128页 |
| 1.7.5 数据处理分析 | 第128页 |
| 1.8 生理指标的测定 | 第128-132页 |
| 1.8.1 低温胁迫电导率的测定 | 第129页 |
| 1.8.2 叶绿素含量的测定 | 第129页 |
| 1.8.3 可溶性糖含量的测定 | 第129-130页 |
| 1.8.4 脯氨酸含量的测定 | 第130页 |
| 1.8.5 野生型植株和转基因株系的含水量 | 第130页 |
| 1.8.6 离体莲座叶片和离体叶片地方部分自然干燥条件下的表型观察 | 第130-131页 |
| 1.8.7 离体叶片失水率的计算 | 第131-132页 |
| 2 结果与分析 | 第132-165页 |
| 2.1 植物表达载体pXCS-HbWRKY-HAStrep和pCAMBIA1304-HbWRKY3构建 | 第132-133页 |
| 2.1.1 植株表达载体pXCS-HbWRKY-HAStrep的构建 | 第132页 |
| 2.1.2 pCAMBIA1304-HbWRKY3植物表达载体的构建 | 第132-133页 |
| 2.2 转基因拟南芥的筛选与鉴定 | 第133-136页 |
| 2.2.1 转HbWRKY2和HbWRKY4拟南芥植株的PCR鉴定和筛选 | 第133-135页 |
| 2.2.2 转HbWRKY3基因拟南芥植株的PCR鉴定和筛选 | 第135-136页 |
| 2.3 转基因株系的Southern杂交鉴定 | 第136-137页 |
| 2.4 转基因株系和野生型植株的RNA的提取和RT-PCR检测 | 第137页 |
| 2.5 转HbWRKY2基因拟南芥的表型观察和功能分析 | 第137-151页 |
| 2.5.1 转HbWRKY2基因拟南芥在不同胁迫下的表型分析 | 第137-139页 |
| 2.5.2 转HbWRKY2基因株系的抗旱性研究 | 第139-140页 |
| 2.5.3 离体叶片的失水率 | 第140-142页 |
| 2.5.4 转HbWRKY2基因株系对高盐和PEG胁迫的耐受性研究 | 第142-144页 |
| 2.5.5 PEG和高盐胁迫下拟南芥下游基因的表达分析 | 第144-145页 |
| 2.5.6 低温胁迫下转基因植株和野生型植株生理指标的测定 | 第145-146页 |
| 2.5.7 低温胁迫下拟南芥低温相关基因的表达分析 | 第146-148页 |
| 2.5.8 乙烯胁迫相关基因AtERS1和AtETR1的表达分析 | 第148页 |
| 2.5.9 响应JA、SA信号途径相关基因的表达分析 | 第148-151页 |
| 2.6 转HbWRKY3基因拟南芥植株表型观察和功能鉴定 | 第151-158页 |
| 2.6.1 转HbWRKY3基因拟南芥植株在不同胁迫下的根系观察 | 第151-153页 |
| 2.6.2 转基因HbWRKY3拟南芥的耐早性分析 | 第153-154页 |
| 2.6.3 转HbWRKY3基因拟南芥株系对高盐和PEG胁迫的耐受性研究 | 第154-155页 |
| 2.6.4 PEG和高盐胁迫下转HbWRKY3拟南芥下游基因的表达分析 | 第155-156页 |
| 2.6.5 低温胁迫下转HbWRKY3拟南芥下游基因的表达分析 | 第156-157页 |
| 2.6.6 乙烯诱导下转HbWRKY3基因株系AtERS1和AtETR1的表达分析 | 第157-158页 |
| 2.7 转HbWRKY4基因拟南芥在不同胁迫中的表型观察和功能鉴定 | 第158-165页 |
| 2.7.1 转HbWRKY4基因拟南芥在不同胁迫中的表型观察 | 第158-159页 |
| 2.7.2 转基因HbWRKY4株系的耐旱性分析 | 第159-161页 |
| 2.7.3 转HbWRKY4基因拟南芥株系对高盐和PEG胁迫的耐受性研究 | 第161-162页 |
| 2.7.4 PEG和高盐胁迫下转HbWRKY4拟南芥中基因AtRD22和AtRD29A的表达分析 | 第162-164页 |
| 2.7.5 乙烯诱导下转HbWRKY4基因株系AtERS1和AtETR1的表达分析 | 第164页 |
| 2.7.6 低温胁迫下转HbWRKY4基因拟南芥株系AtCOR15A,AtCOR47基因的表达分析 | 第164-165页 |
| 3 讨论 | 第165-168页 |
| 3.1 HbWRKY超表达转基因拟南芥提高了抗旱性 | 第165页 |
| 3.2 HbWRKY超表达提高了植株对高盐的抗性 | 第165-166页 |
| 3.3 HbWRKY超表达植株响应PEG胁迫 | 第166页 |
| 3.4 HbWRKY3响应乙烯诱导 | 第166-167页 |
| 3.5 转基因植株响应ABA诱导 | 第167页 |
| 3.6 HbWRKY2超表达响应JA和SA诱导 | 第167-168页 |
| 3.7 HbWRKY超表达植株响应低温胁迫 | 第168页 |
| 4 小结 | 第168-170页 |
| 第五章 HbWRKY2和HbWRKY4基因遗传转化橡胶树的研究 | 第170-185页 |
| 1. 材料与方法 | 第170-176页 |
| 1.1 材料 | 第170-171页 |
| 1.2 试验所用试剂和组织培养条件 | 第171-172页 |
| 1.2.1 试验所用重要试剂 | 第171页 |
| 1.2.2 组织培养条件 | 第171页 |
| 1.2.3 试验所用培养基及成分 | 第171-172页 |
| 1.3 试验方法 | 第172-176页 |
| 1.3.1 植物表达载体的构建 | 第172-173页 |
| 1.3.2 重组子的电转化 | 第173页 |
| 1.3.3 根癌农杆菌的培养 | 第173页 |
| 1.3.4 GV3101-pXCS-HbWRKY4-HAStrep转化橡胶树热研8-79愈伤组织 | 第173-174页 |
| 1.3.5 EHA105-pCAMBIA2301-HbWRKY2转化橡胶树愈伤组织 | 第174页 |
| 1.3.6 体细胞胚诱导及植株再生 | 第174-175页 |
| 1.3.7 转化子的PCR检测和序列分析 | 第175页 |
| 1.3.8 转化子的Southern杂交检测 | 第175-176页 |
| 2 结果与分析 | 第176-182页 |
| 2.1 不同浓度双丙氨磷对橡胶树胚性愈伤组织生长的影响 | 第176-177页 |
| 2.2 共培养时间对不同品种橡胶树愈伤组织转化效率的影响 | 第177页 |
| 2.3 抗性愈伤组织的筛选 | 第177-179页 |
| 2.3.1 转pXCS-HbWRKY4-HAStrep抗性愈伤组织的筛选和植株再生 | 第177-178页 |
| 2.3.2 转pCAMBIA2301-HbWRKY2抗性愈伤组织的筛选 | 第178-179页 |
| 2.4 抗性再生植株的PCR和Southern杂交鉴定 | 第179-182页 |
| 2.4.1 转pXCS-HbWRKY4-HAStrep的PCR鉴定 | 第179-180页 |
| 2.4.2 转pXCS-HbWRKY4-HAStrep的Southern杂交鉴定 | 第180-181页 |
| 2.4.3 转HbWRKY2的抗性愈伤组织的PCR鉴定 | 第181-182页 |
| 3 讨论 | 第182-184页 |
| 3.1 双丙氨磷在橡胶树转化中的应用 | 第182-183页 |
| 3.2 双丙氨磷在橡胶树转化中的适宜浓度 | 第183页 |
| 3.3 双丙氨磷在橡胶树转化中对植株再生率的影响 | 第183页 |
| 3.4 共培养时间对橡胶树转化效率的影响 | 第183-184页 |
| 3.5 外植体对橡胶树转化效率的影响 | 第184页 |
| 4 小结 | 第184-185页 |
| 结论 | 第185-187页 |
| 参考文献 | 第187-204页 |
| 致谢 | 第204-206页 |
| 作者简介 | 第206页 |
