| 摘要 | 第5-7页 |
| ABSTRACT | 第7-8页 |
| 符号说明 | 第13-15页 |
| 第一章 文献综述 | 第15-53页 |
| 1.1 DNA甲基化及SRA结构域 | 第15-33页 |
| 1.1.1 DNA甲基化简介 | 第15-16页 |
| 1.1.2 真核生物中DNA甲基化 | 第16-18页 |
| 1.1.3 UHRF1的功能及SRA_(UHRF1)的结构 | 第18-23页 |
| 1.1.4 SUVH5的功能及SRA_(SUVH5)的结构 | 第23-32页 |
| 1.1.5 原核生物中DNA甲基化的功能 | 第32-33页 |
| 1.2 限制性内切酶简介 | 第33-47页 |
| 1.2.1 限制修饰系统的分类 | 第33-35页 |
| 1.2.2 IV限制系统与甲基化依赖型限制酶 | 第35-36页 |
| 1.2.3 包含类SRA结构域的甲基化依赖性限制性内切酶研究进展 | 第36-42页 |
| 1.2.4 HNH/ββα-Me类限制性内切酶及锌指结构(Zinc finger) | 第42-47页 |
| 1.3 天蓝色链霉菌及基因组岛 | 第47-52页 |
| 1.3.1 链霉菌简介 | 第47页 |
| 1.3.2 变铅青链霉菌及磷硫酰化修饰 | 第47-49页 |
| 1.3.3 天蓝色链霉菌及其多重限制修饰系统 | 第49-52页 |
| 1.4 本课题研究切入点 | 第52-53页 |
| 第二章 材料与方法 | 第53-67页 |
| 2.1 菌株，质粒和引物 | 第53-56页 |
| 2.1.1 菌株 | 第53-54页 |
| 2.1.2 质粒 | 第54页 |
| 2.1.3 PCR引物 | 第54-55页 |
| 2.1.4 寡核苷酸序列 | 第55-56页 |
| 2.2 实验材料 | 第56-59页 |
| 2.2.1 商业化内切酶缓冲液成分列表 | 第56-57页 |
| 2.2.2 培养基和实验试剂 | 第57-59页 |
| 2.3 实验方法 | 第59-67页 |
| 2.3.1 菌种培养及保存 | 第59-60页 |
| 2.3.2 大肠杆菌质粒的提取 | 第60页 |
| 2.3.3 聚合酶链式反应 (PCR) | 第60页 |
| 2.3.4 DNA的沉淀，酶切，回收，连接 | 第60-61页 |
| 2.3.5 大肠杆菌钙转感受态细胞制备 | 第61页 |
| 2.3.6 大肠杆菌钙转感受态细胞的转化 | 第61-62页 |
| 2.3.7 蛋白表达及纯化 | 第62页 |
| 2.3.8 生物信息学分析 | 第62-63页 |
| 2.3.9 Sco5333点突变蛋白及MBD_(mMeCP2)的表达克隆构建 | 第63页 |
| 2.3.10 凝胶迁移实验 (EMSA) | 第63-64页 |
| 2.3.11 Sco5333保护的BstNI酶切实验 | 第64页 |
| 2.3.12 等温滴定量热 (ITC) 测定K_D值 | 第64页 |
| 2.3.13 凝胶过滤法测定蛋白绝对分子量 | 第64-65页 |
| 2.3.14 DNA切割反应 | 第65页 |
| 2.3.15 大肠杆菌生长曲线测定 | 第65页 |
| 2.3.16 链霉菌总DNA提取 | 第65页 |
| 2.3.17 两亲本接合转移 | 第65-66页 |
| 2.3.18 孢子杂交 | 第66-67页 |
| 第三章 天蓝色链霉菌甲基化依赖型限制系统的筛选 | 第67-75页 |
| 3.1 研究背景及前期工作简介 | 第67-68页 |
| 3.2 候选DNA甲基化依赖型限制系统的分析和确定 | 第68-75页 |
| 第四章 Sco5333蛋白的结构分析 | 第75-85页 |
| 4.1 Sco5333的SRA结构分析 | 第75-81页 |
| 4.1.1 SRA_(Sco5333)的序列比对及二级结构分析 | 第75-77页 |
| 4.1.2 SRA_(Sco5333)的三级结构预测及分析 | 第77-81页 |
| 4.2 Sco5333的HNH结构分析 | 第81-85页 |
| 4.2.1 HNH_(Sco5333)的序列比对分析 | 第81-83页 |
| 4.2.2 HNH_(Sco5333)的三级结构分析 | 第83-85页 |
| 第五章 sco5333基因的点突变分析 | 第85-89页 |
| 5.1 sco5333的突变位点选择 | 第85-87页 |
| 5.2 Sco5333点突变表达质粒的体内致死效应检测 | 第87-89页 |
| 第六章 Sco5333对甲基化DNA的体外结合活性检测 | 第89-109页 |
| 6.1 Sco5333的表达纯化 | 第89-90页 |
| 6.2 Sco5333体外特异性结合 5mC甲基化的DNA | 第90-91页 |
| 6.3 Sco5333在体外对 5mC甲基化DNA的识别及结合位点的鉴定 | 第91-101页 |
| 6.3.1 Sco5333在pUC18上的结合位点鉴定 | 第91-94页 |
| 6.3.2 Sco5333对多种 5mC甲基化类型修饰的识别及结合 | 第94-96页 |
| 6.3.3 精细确定Sco5333识别 5mC的序列特异性 | 第96-100页 |
| 6.3.4 Sco5333能够结合单链 5mC DNA | 第100-101页 |
| 6.4 Sco5333对 5mC DNA的结合力测定 | 第101-106页 |
| 6.4.1 梯度滴定法比较Sco5333对 5mC甲基化与非甲基化DNA的结合差异 | 第101-102页 |
| 6.4.2 等温量热滴定(ITC)测定Sco5333对 5mC甲基化DNA的结合力及分子比 | 第102-104页 |
| 6.4.3 凝胶过滤法测定Sco5333的绝对分子量 | 第104-106页 |
| 6.5 Sco5333的SRA结构域负责体外结合 5mC DNA | 第106-109页 |
| 第七章 Sco5333体外切割甲基化DNA | 第109-117页 |
| 7.1 Sco5333在体外对Dcm修饰的pUC18有微弱的nick及切割活性 | 第109-111页 |
| 7.2 Sco5333在高浓度下的体外非特异性切割活性 | 第111-117页 |
| 7.2.1 Sco5333在体外能非特异性的切割非Dcm甲基化修饰的pUC18 DNA | 第111-112页 |
| 7.2.2 包含Sco5333及突变蛋白的表达克隆的BL21的生长曲线测定 | 第112-113页 |
| 7.2.3 Sco5333的体外切割活性来自自身而非核酸酶污染 | 第113-115页 |
| 7.2.4 Sco5333不能切割多种甲基化形式的 219 bp DNA | 第115-117页 |
| 第八章 Zn~(2+)对Sco5333的结合与切割活性的影响 | 第117-125页 |
| 8.1 Zn~(2+)对Sco5333结合活性的影响 | 第118-119页 |
| 8.2 Zn~(2+)对Sco5333切割活性的影响 | 第119-122页 |
| 8.2.1 Zn~(2+)能够抑制Sco5333的切割活性 | 第119-120页 |
| 8.2.2 锌指结构被破坏的Sco5333C252D具有更强的切割活性 | 第120-122页 |
| 8.3 Zn~(2+)介导Sco5333蛋白变构假说 | 第122-125页 |
| 8.3.1 Sco5333的原始构象在没有Zn~(2+)存在时处于“切割态” | 第122-123页 |
| 8.3.2 Zn~(2+)使Sco5333蛋白变构为“结合态” | 第123页 |
| 8.3.3 Zn~(2+)赋予Sco5333C252D切割活性并能与其它二价金属离子竞争 | 第123-125页 |
| 第九章 sco5333所在基因组岛Gi-12的可移动性研究 | 第125-133页 |
| 9.1 Gi-12被预测为一个放线菌整合型接合元件(AICE) | 第125-128页 |
| 9.2 孢子杂交验证Gi-12的可移动性 | 第128-133页 |
| 第十章 总结与展望 | 第133-137页 |
| 10.1 本研究工作总结 | 第133页 |
| 10.2 本研究主要创新点 | 第133-134页 |
| 10.3 进一步工作和展望 | 第134-137页 |
| 10.3.1 Gi-12上未知基因的功能探索 | 第134页 |
| 10.3.2 Sco5333的体内限制机制及体外切割条件探索 | 第134-135页 |
| 10.3.3 Sco5333的结构生物学研究 | 第135页 |
| 10.3.4 Sco5333的作为 5mC DNA富集工具酶的潜力 | 第135-137页 |
| 参考文献 | 第137-145页 |
| 致谢 | 第145-147页 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 | 第147页 |
