| 摘要 | 第10-13页 |
| Abstract | 第13-15页 |
| 缩略词表 | 第16-18页 |
| 前言 | 第18-29页 |
| 1 毕赤酵母表达系统 | 第18-24页 |
| 1.1 毕赤酵母表达系统的优点 | 第18-19页 |
| 1.2 酵母的N-糖基化途径 | 第19-22页 |
| 1.3 毕赤酵母N-糖基化改造的研究进展 | 第22-24页 |
| 2 糖基化对蛋白药物的影响 | 第24-25页 |
| 3 乳清酸4-二硫化蛋白(WFDC2) | 第25-28页 |
| 4 本课题的研究目的 | 第28-29页 |
| 第一章 毕赤酵母糖基工程改造 | 第29-129页 |
| 一 毕赤酵母糖基工程改——OCH1基因的敲除 | 第29-78页 |
| 前言 | 第29页 |
| 1 材料 | 第29-34页 |
| 1.1 菌种与质粒 | 第29页 |
| 1.2 工具酶、抗体 | 第29-30页 |
| 1.3 主要试剂及试剂盒 | 第30页 |
| 1.4 主要仪器 | 第30-32页 |
| 1.5 培养基 | 第32-33页 |
| 1.6 主要溶液 | 第33-34页 |
| 2 试验方法 | 第34-57页 |
| 2.1 pZBMFC2正反向筛选载体的构建和鉴定 | 第34-41页 |
| 2.2 毕赤酵母KM71 OCH1基因敲除质粒pBMZOCH1的构建和鉴定 | 第41-45页 |
| 2.3 敲除毕赤酵母KM71的OCH1基因 | 第45-46页 |
| 2.4 OCH1基因敲除菌株的表型鉴定 | 第46-47页 |
| 2.5 表达载体pPICZaA-WFDC2的构建 | 第47-48页 |
| 2.7 WFDC2在毕赤酵母Kochl和KM71中的表达 | 第48-52页 |
| 2.8 WFDC2蛋白的纯化 | 第52-54页 |
| 2.9 WFDC2蛋白的糖链分析 | 第54-57页 |
| 3 结果与分析 | 第57-75页 |
| 3.1 pZBMFC2正反向筛选载体的构建 | 第57-58页 |
| 3.2 mazF基因对毕赤酵母毒性的验证 | 第58-59页 |
| 3.3 毕赤酵母KM71 OCH1基因敲除质粒pBMZOCH1的构建 | 第59-60页 |
| 3.4 全长回复质粒pPICZBOCH1的构建 | 第60页 |
| 3.5 敲除毕赤酵母KM71的OCH1基因 | 第60-62页 |
| 3.6 OCH1基因敲除菌株的表型鉴定 | 第62-64页 |
| 3.7 表达载体pPICZaA-WFDC2的鉴定 | 第64-65页 |
| 3.8 WFDC2表达菌株的鉴定 | 第65-69页 |
| 3.9 RNase B的N-糖基化分析方法的建立 | 第69-72页 |
| 3.10 K-WFDC2蛋白的糖链分析 | 第72-74页 |
| 3.11 Kochl-WFDC2的糖链分析 | 第74-75页 |
| 4 讨论 | 第75-78页 |
| 二 毕赤酵母糖基工程改造——N-糖酰胺酶F(PNGase F)的重组表达 | 第78-95页 |
| 前言 | 第78页 |
| 1 材料 | 第78-79页 |
| 1.1 菌种与质粒 | 第78页 |
| 1.2 工具酶、抗体 | 第78页 |
| 1.3 主要溶液 | 第78-79页 |
| 2 试验方法 | 第79-84页 |
| 2.1 PNGase F基因的密码子优化和合成 | 第79页 |
| 2.2 酵母重组表达载体pPICZaA-PF的构建 | 第79-81页 |
| 2.3 重组质粒pPICZaA-PF的抽提和鉴定 | 第81-82页 |
| 2.4 重组表达PNGase F酵母的构建 | 第82页 |
| 2.5 重组PNGase F阳性菌株试管诱导上清的活性鉴定 | 第82-83页 |
| 2.6 重组PNGase F的高密度发酵和鉴定 | 第83-84页 |
| 2.7 纯化样品的脱糖基化作用测定 | 第84页 |
| 3 结果与分析 | 第84-93页 |
| 3.1 PNGase F基因的密码子优化和合成 | 第84-85页 |
| 3.2 酵母重组表达载体pPICZaA-PF的构建 | 第85-87页 |
| 3.3 pPICZaA-PF重组克隆的快速筛选与双酶切鉴定 | 第87页 |
| 3.4 重组PNGase F质粒pPICZaA-PF线性化后电转化入毕赤酵母KM71 | 第87-88页 |
| 3.5 重组PNGase F在毕赤酵母内的表达筛选 | 第88-89页 |
| 3.6 重组PNGase F阳性菌株的试管诱导检测 | 第89-90页 |
| 3.7 重组PNGase F菌株试管诱导上清的活性鉴定 | 第90页 |
| 3.8 重组PNGase F的高密度发酵和纯化 | 第90-91页 |
| 3.9 纯化后PNGase F的脱糖基化作用测定 | 第91-93页 |
| 4 讨论 | 第93-95页 |
| 三 毕赤酵母糖基工程改a-1,2甘露糖苷酶Ⅰ的表达和活性检测 | 第95-117页 |
| 前言 | 第95页 |
| 1 材料 | 第95-96页 |
| 1.1 菌种与质粒 | 第95页 |
| 1.2 工具酶、抗体 | 第95页 |
| 1.3 主要试剂及试剂盒 | 第95页 |
| 1.4 主要溶液和培养基 | 第95-96页 |
| 2 试验方法 | 第96-106页 |
| 2.1 表达载体pBKS-Arg1的构建 | 第96-98页 |
| 2.2 敲除载体pARGM1的构建 | 第98-99页 |
| 2.3 arg1营养缺陷菌的构建 | 第99-100页 |
| 2.4 绿色木霉(T.reesei)mds基因的获取 | 第100-102页 |
| 2.5 表达载体pAGAPM5的构建 | 第102-105页 |
| 2.6 mds基因转入毕赤酵母KM71(och1△、arg1△) | 第105页 |
| 2.7 pAGAPM5酵母转化子的鉴定 | 第105页 |
| 2.8 KMoch1-WFDC2转化子诱导表达及报告蛋白的纯化 | 第105页 |
| 2.9 KMoch1-WFDC2的N-糖链分析 | 第105-106页 |
| 3 结果与分析 | 第106-115页 |
| 3.1 表达载体pBKS-Arg1的构建 | 第106-108页 |
| 3.2 敲除载体pARGM1的构建 | 第108页 |
| 3.3 arg1营养缺陷菌的构建 | 第108-109页 |
| 3.4 mds基因的钓取 | 第109-110页 |
| 3.5 表达载体pAGAPM5的构建 | 第110-111页 |
| 3.6 Mns Ⅰ在毕赤酵母KM71(och1△,arg1△)中的表达 | 第111-113页 |
| 3.7 Mns Ⅰ的活性鉴定 | 第113-115页 |
| 4 讨论 | 第115-117页 |
| 四 毕赤酵母糖基工程改造—β-1,2-N-乙酰葡萄糖转移酶Ⅰ的表达和活性检测 | 第117-129页 |
| 前言 | 第117页 |
| 1 材料 | 第117页 |
| 1.1 菌株与质粒 | 第117页 |
| 1.2 工具酶、抗体 | 第117页 |
| 1.3 试剂盒 | 第117页 |
| 2 试验方法 | 第117-121页 |
| 2.1 目的基因mnn9-gnt Ⅰ的拼接 | 第117-119页 |
| 2.2 表达载体pPIC9-GnT Ⅰ的构建 | 第119-120页 |
| 2.3 表达载体pPIC9-GnT Ⅰ在毕赤酵母KMoch1的转化 | 第120-121页 |
| 2.4 GnT Ⅰ在毕赤酵母KMoch1内的活性鉴定 | 第121页 |
| 3 结果与分析 | 第121-127页 |
| 3.1 目的基因mnn9-gnt Ⅰ的拼接 | 第121-123页 |
| 3.2 表达载体pPIC9-GnT Ⅰ的构建 | 第123页 |
| 3.3 表达载体pPIC9-GnT Ⅰ的转化鉴定 | 第123-124页 |
| 3.4 WFDC2在毕赤酵母KMoGnT Ⅰ内的诱导表达及纯化 | 第124-125页 |
| 3.5 GnT Ⅰ在毕赤酵母KMoch1内的活性鉴定 | 第125-127页 |
| 4 讨论 | 第127-129页 |
| 第三章 WFDC2的生物活性探讨 | 第129-165页 |
| 一 哺乳动物细胞293F表达WFDC2蛋白 | 第129-145页 |
| 前言 | 第129页 |
| 1 材料 | 第129-130页 |
| 1.1 菌株与质粒 | 第129页 |
| 1.2 工具酶与试剂 | 第129页 |
| 1.3 抗体与试剂盒 | 第129-130页 |
| 1.4 仪器 | 第130页 |
| 1.5 主要溶液 | 第130页 |
| 2 试验方法 | 第130-135页 |
| 2.1 表达载体HXT-WFDC2的构建 | 第130-132页 |
| 2.2 293F细胞株的培养 | 第132-133页 |
| 2.3 WFDC2在293F细胞中的瞬时表达 | 第133-134页 |
| 2.4 WFDC2的N-糖链分析 | 第134-135页 |
| 3 结果与分析 | 第135-143页 |
| 3.1 表达载体HXT-WFDC2的构建 | 第135-136页 |
| 3.2 293F细胞中的瞬时表达 | 第136-139页 |
| 3.3 293F-WFDC2的N-糖基化分析 | 第139-143页 |
| 4 讨论 | 第143-145页 |
| 二 不同糖基化修饰对WFDC2生物活性的影响 | 第145-165页 |
| 前言 | 第145页 |
| 1 材料 | 第145-147页 |
| 1.1 菌株 | 第145页 |
| 1.2 试剂 | 第145页 |
| 1.3 主要溶液和培养基 | 第145-147页 |
| 2 试验方法 | 第147-152页 |
| 2.1 WFDC2蛋白的细菌亲和试验 | 第147页 |
| 2.2 WFDC2的蛋白酶抑制试验 | 第147-152页 |
| 2.3 WFDC2蛋白的细菌聚集试验 | 第152页 |
| 2.4 WFDC2蛋白的抑菌试验 | 第152页 |
| 3 结果 | 第152-161页 |
| 3.1 WFDC2蛋白的细菌亲和试验 | 第152-153页 |
| 3.2 WFDC2的蛋白酶抑制试验 | 第153-159页 |
| 3.3 WFDC2蛋白的细菌聚集试验 | 第159-160页 |
| 3.4 WFDC2蛋白的抑菌试验 | 第160-161页 |
| 4 讨论 | 第161-165页 |
| 第四章 总结 | 第165-167页 |
| 1 本研究取得的成果 | 第165-166页 |
| 2 本试验有待解决的问题 | 第166-167页 |
| 参考文献 | 第167-180页 |
| 附录 | 第180-183页 |
| 1 主要引物设计序列表 | 第180-181页 |
| 2 菌株基因型表 | 第181-182页 |
| 3 在读期间发表的论文 | 第182-183页 |
| 致谢 | 第183页 |
