| 摘要 | 第5-8页 |
| ABSTRACT | 第8-10页 |
| 第1章 前言 | 第14-30页 |
| 1.1 MicroRNAs概述 | 第14-17页 |
| 1.1.1 MicroRNAs的特征及分布 | 第14页 |
| 1.1.2 MicroRNAs的研究历史 | 第14-15页 |
| 1.1.3 MicroRNAs的生物加工过程 | 第15页 |
| 1.1.4 MicroRNAs的作用机制 | 第15-16页 |
| 1.1.5 MicroRNAs的表达特性 | 第16-17页 |
| 1.1.6 MicroRNAs的生物学功能 | 第17页 |
| 1.2 CRISPR-Cas9系统 | 第17-25页 |
| 1.2.1 CRISPR-Cas9系统的兴起 | 第17-18页 |
| 1.2.2 CRISPR-Cas9系统的发展历史 | 第18-19页 |
| 1.2.3 CRISPR-Cas9系统的结构特点与作用机制 | 第19-21页 |
| 1.2.4 CRISPR-Cas9系统的应用 | 第21-22页 |
| 1.2.5 CRISPR-Cas9系统的研究现状 | 第22-23页 |
| 1.2.6 CRISPR-Cas9系统存在的问题 | 第23-25页 |
| 1.3 性发育概述 | 第25-26页 |
| 1.4 立题背景 | 第26-28页 |
| 1.4.1 miR-505与性发育 | 第26页 |
| 1.4.2 miR-29a与性发育 | 第26-27页 |
| 1.4.3 GT1-7细胞系 | 第27页 |
| 1.4.4 利用CRISPR-Cas9系统进行miRNAs基因敲除 | 第27-28页 |
| 1.5 研究内容 | 第28-29页 |
| 1.6 研究意义 | 第29-30页 |
| 第2章 材料与方法 | 第30-57页 |
| 2.1 材料 | 第30-35页 |
| 2.1.1 质粒、细胞系和小鼠 | 第30页 |
| 2.1.2 实验仪器与试剂 | 第30-35页 |
| 2.2 方法 | 第35-57页 |
| 2.2.1 基因工程小鼠的基因分型 | 第35-36页 |
| 2.2.2 小鼠饲养和表型观测 | 第36-37页 |
| 2.2.3 Cas9稳转GT1-7细胞系的构建 | 第37-39页 |
| 2.2.4 42230-SF2表达载体构建 | 第39-44页 |
| 2.2.5 sgRNA-EGFP表达载体构建 | 第44-47页 |
| 2.2.6 T7E1法检测基因突变率 | 第47-48页 |
| 2.2.7 流式细胞术 | 第48-49页 |
| 2.2.8 基因表达量的检测 | 第49-54页 |
| 2.2.9 MTT检测 | 第54页 |
| 2.2.10 细胞培养的常规操作 | 第54-56页 |
| 2.2.11 数据分析及作图 | 第56-57页 |
| 第3章 结果与分析 | 第57-84页 |
| 3.1 mmu-sgRNA505的设计 | 第57页 |
| 3.2 miR-505基因工程小鼠的构建和验证 | 第57-63页 |
| 3.2.1 miR-505基因工程小鼠Founder的回交 | 第57-58页 |
| 3.2.2 T7E1法对miR-505基因工程小鼠进行基因分型 | 第58-59页 |
| 3.2.3 利用377电泳对miR-505基因工程小鼠进行基因分型 | 第59-60页 |
| 3.2.4 两种基因型小鼠miR-505表达量的检测 | 第60-62页 |
| 3.2.5 两种基因型小鼠miR-505二级结构预测 | 第62-63页 |
| 3.3 miR-505表达量缺失雌鼠性发育表型与生殖能力观测 | 第63-68页 |
| 3.3.1 miR-505表达量缺失雌鼠生长曲线 | 第63-64页 |
| 3.3.2 miR-505表达量缺失雌鼠阴门开启时间 | 第64-66页 |
| 3.3.3 miR-505表达量缺失雌鼠生殖能力检测 | 第66-68页 |
| 3.4 Cas9稳转GT1-7细胞系的构建 | 第68-70页 |
| 3.4.1 嘌呤霉素在GT1-7细胞中最低致死浓度筛选 | 第68-69页 |
| 3.4.2 Cas9稳转GT1-7细胞的获得 | 第69-70页 |
| 3.5 Cas9稳转GT1-7细胞的验证 | 第70-71页 |
| 3.5.1 Cas9稳转GT1-7细胞基因水平的验证 | 第70页 |
| 3.5.2 Cas9稳转GT1-7细胞表达量水平的验证 | 第70-71页 |
| 3.6 利用Cas9稳转GT1-7细胞进行基因编辑 | 第71-72页 |
| 3.7 sgRNA-EGFP表达载体的构建与验证 | 第72-75页 |
| 3.7.1 42230和FUGW表达载体的酶切、连接 | 第72页 |
| 3.7.2 重组质粒的菌落PCR | 第72-73页 |
| 3.7.3 测序验证重组质粒sgRNA-EGFP | 第73-74页 |
| 3.7.4 细胞水平验证sgRNA-EGFP和sgRNA29a-EGFP质粒 | 第74-75页 |
| 3.8 流式细胞术富集miR-29a基因突变Cas9稳转GT1-7细胞 | 第75-76页 |
| 3.9 富集miR-29a基因突变Cas9稳转GT1-7细胞的检测 | 第76-77页 |
| 3.9.1 富集Cas9稳转GT1-7细胞miR-29a基因突变率检测 | 第76页 |
| 3.9.2 富集Cas9稳转GT1-7细胞miR-29a表达量检测 | 第76-77页 |
| 3.10 miR-29a基因突变单克隆细胞的获得与检测 | 第77-79页 |
| 3.10.1 miR-29a基因突变单克隆细胞的获得 | 第77页 |
| 3.10.2 Clonel | 第77-78页 |
| 3.10.3 Clone 1 | 第78-79页 |
| 3.11 miR-29a在GT1-7细胞中的靶基因预测 | 第79-80页 |
| 3.12 miR-29a在GT1-7细胞中预测靶基因的验证 | 第80-84页 |
| 3.12.1 利用FUGW质粒在GT1-7细胞中过表达miR-29a和miR-29b | 第80-82页 |
| 3.12.2 miR-29a或miR-29b过表达Cas9稳转GT1-7细胞中预测靶基因表达量 | 第82-84页 |
| 第4章 讨论 | 第84-88页 |
| 4.1 动物水平实验 | 第84-85页 |
| 4.1.1 377电泳法进行基因工程小鼠分型 | 第84页 |
| 4.1.2 CRISPR-Cas9系统造成miRNAs基因突变位置对于miRNAs表达的影响 | 第84-85页 |
| 4.1.3 miR-505对雌鼠性发育和生殖能力的影响 | 第85页 |
| 4.2 细胞水平实验 | 第85-88页 |
| 4.2.1 Cas9稳转GT1-7细胞的构建 | 第85-86页 |
| 4.2.2 miR-29a表达量稳定缺失GT1-7细胞的构建 | 第86页 |
| 4.2.3 miR-29a在GT1-7细胞中的生物学功能 | 第86-88页 |
| 第5章 结论与展望 | 第88-91页 |
| 5.1 结论 | 第88-89页 |
| 5.2 展望 | 第89-91页 |
| 参考文献 | 第91-101页 |
| 课题来源 | 第101-102页 |
| 攻读硕士学位期间发表学术论文目录 | 第102-103页 |
| 致谢 | 第103-104页 |
