| 中文摘要 | 第9-11页 |
| Abstract | 第11-12页 |
| 1 前言 | 第13-30页 |
| 1.1 极端微生物研究概况 | 第13-16页 |
| 1.1.1 极端微生物研究背景 | 第13页 |
| 1.1.2 极端微生物的生理机制 | 第13-15页 |
| 1.1.2.1 嗜热微生物耐热机制 | 第13-14页 |
| 1.1.2.2 嗜冷微生物的适冷机制 | 第14页 |
| 1.1.2.3 嗜盐微生物的耐盐机制 | 第14页 |
| 1.1.2.4 嗜酸微生物的耐酸机制 | 第14-15页 |
| 1.1.3 极端微生物的应用 | 第15-16页 |
| 1.2 纤维素的研究概况 | 第16-17页 |
| 1.2.1 纤维素的经济价值 | 第16-17页 |
| 1.2.2 纤维素的分子构成及分子链构型 | 第17页 |
| 1.2.3 纤维素的降解 | 第17页 |
| 1.3 纤维素酶的研究概况 | 第17-25页 |
| 1.3.1 纤维素酶的研究背景 | 第18页 |
| 1.3.2 纤维素酶系的组成 | 第18-20页 |
| 1.3.3 纤维素酶的空间结构与功能 | 第20-22页 |
| 1.3.4 纤维素酶基因的克隆 | 第22-23页 |
| 1.3.5 纤维素酶基因的表达 | 第23-24页 |
| 1.3.5.1 纤维素酶基因的原核表达 | 第23页 |
| 1.3.5.2 纤维素酶基因的真核表达 | 第23-24页 |
| 1.3.6 纤维素酶的应用 | 第24-25页 |
| 1.4 酶的分子改造 | 第25-27页 |
| 1.4.1 酶分子改造的研究方法 | 第25页 |
| 1.4.2 同源建模 | 第25-27页 |
| 1.4.2.1 同源建模的原理及步骤 | 第26页 |
| 1.4.2.2 同源建模技术在纤维素酶分子改造中的应用 | 第26-27页 |
| 1.5 选题的目的意义、研究内容、技术路线 | 第27-30页 |
| 1.5.1 选题的目的及意义 | 第27-28页 |
| 1.5.2 研究内容 | 第28-29页 |
| 1.5.3 技术路线 | 第29-30页 |
| 2 材料方法 | 第30-50页 |
| 2.1 实验材料 | 第30-32页 |
| 2.1.1 供试菌株 | 第30页 |
| 2.1.2 酶及生化试剂 | 第30页 |
| 2.1.3 仪器 | 第30-31页 |
| 2.1.4 溶液配制 | 第31页 |
| 2.1.5 培养基配配制 | 第31-32页 |
| 2.2 嗜热毛壳菌外切纤维二糖水解酶CBH3与内切葡聚糖酶EG2基因的克隆 | 第32-36页 |
| 2.2.1 目的基因的诱导表达 | 第32页 |
| 2.2.2 毛壳菌总RNA的提取 | 第32-33页 |
| 2.2.3 PCR引物设计 | 第33页 |
| 2.2.4 反转录cDNA第一链的合成 | 第33-34页 |
| 2.2.5 克隆载体的构建 | 第34-35页 |
| 2.2.5.1 CBH3、EG2基因的PCR扩增 | 第34页 |
| 2.2.5.2 PCR产物回收 | 第34-35页 |
| 2.2.5.3 片段与克隆载体连接 | 第35页 |
| 2.2.6 大肠杆菌感受态的转化 | 第35-36页 |
| 2.2.7 重组质粒的提取 | 第36页 |
| 2.3 外切纤维二糖水解酶CBH3和内切葡聚糖酶EG2的高效表达及性质研究 | 第36-47页 |
| 2.3.1 CBH3、EG2毕赤酵母表达载体的构建 | 第36-39页 |
| 2.3.1.1 目的基因及表达质粒的双酶切 | 第37-38页 |
| 2.3.1.2 目的基因与表达质粒的连接 | 第38页 |
| 2.3.1.3 毕赤酵母表达载体的克隆与鉴定 | 第38-39页 |
| 2.3.2 pPIC9K/CBH3与pPIC9K/EG2毕赤酵母工程菌的构建 | 第39-44页 |
| 2.3.2.1 毕赤酵母表达载体的线性化和去磷酸化 | 第39-40页 |
| 2.3.2.2 毕赤酵母GS115电击转化感受态的制备 | 第40-41页 |
| 2.3.2.3 pPIC9K/CBH3与pPIC9K/EG2重组表达载体电击转化入毕赤酵母中 | 第41页 |
| 2.3.2.4 pPIC9K/CBH3与pPIC9K/EG2毕赤酵母转化子的筛选与鉴定 | 第41-44页 |
| 2.3.3 pPIC9K/CBH3与pPIC9K/EG2毕赤酵母工程菌的诱导表达 | 第44页 |
| 2.3.4 pPIC9K/CBH3与pPIC9K/EG2毕赤酵母工程菌诱导表达蛋白的纯化 | 第44-45页 |
| 2.3.4.1 毕赤酵母发酵液的收集 | 第44页 |
| 2.3.4.2 发酵蛋白的硫酸铵沉淀与透析 | 第44-45页 |
| 2.3.4.3 pPIC9K/CBH3与pPIC9K/EG2酵母工程菌发酵蛋白的镍柱亲和层析 | 第45页 |
| 2.3.5 pPIC9K/CBH3与pPIC9K/EG2纯化蛋白的性质研究 | 第45-47页 |
| 2.3.5.1 纯化蛋白SDS-PAGE分析 | 第46页 |
| 2.3.5.2 蛋白质含量测定 | 第46页 |
| 2.3.5.3 纯化蛋白活性测定 | 第46-47页 |
| 2.4 嗜热毛壳菌外切纤维二糖水解酶CBH3的定点突变及相关蛋白性质研究 | 第47-50页 |
| 2.4.1 同源建模确定突变位点 | 第47页 |
| 2.4.2 突变基因的获取 | 第47-49页 |
| 2.4.2.1 定点突变引物的设计 | 第47-48页 |
| 2.4.2.2 定点突变PCR扩增 | 第48-49页 |
| 2.4.3 突变质粒的克隆 | 第49页 |
| 2.4.3.1 突变质粒转化入大肠杆菌感受态细胞 | 第49页 |
| 2.4.3.2 筛选阳性转化子 | 第49页 |
| 2.4.4 五个突变基因毕赤酵母工程菌的构建 | 第49页 |
| 2.4.5 五个突变基因毕赤酵母工程菌的诱导表达 | 第49页 |
| 2.4.6 五个突变基因毕赤酵母工程菌诱导表达蛋白的纯化 | 第49页 |
| 2.4.7 五个突变蛋白的性质研究 | 第49-50页 |
| 3 结果与分析 | 第50-73页 |
| 3.1 CBH3、EG2在毕赤酵母中高效的表达及性质研究 | 第50-60页 |
| 3.1.1 嗜热毛壳菌总RNA的提取 | 第50页 |
| 3.1.2 CBH3、EG2基因的PCR扩增 | 第50-51页 |
| 3.1.3 CBH3、EG2毕赤酵母表达载体的鉴定 | 第51-52页 |
| 3.1.4 毕赤酵母工程菌的构建和鉴定 | 第52-55页 |
| 3.1.4.1 营养缺陷培养基筛选毕赤酵母阳性转化子 | 第52-53页 |
| 3.1.4.2 pPIC9K/CBH3与pPIC9K/EG2基因多拷贝转化子的G418筛选 | 第53-54页 |
| 3.1.4.3 pPIC9K/CBH3与pPIC9K/EG2酵母转化子的PCR验证 | 第54-55页 |
| 3.1.5 CBH3与EG2蛋白的诱导表达及纯化 | 第55-57页 |
| 3.1.6 内切葡聚糖酶EG2酶学性质的测定 | 第57-60页 |
| 3.1.6.1 CBH3与EG2酶活力的测定 | 第57-58页 |
| 3.1.6.2 温度对内切葡聚糖酶EG2酶活力的影响 | 第58页 |
| 3.1.6.3 pH对内切葡聚糖酶EG2酶活力的影响 | 第58-59页 |
| 3.1.6.4 不同底物对内切葡聚糖酶EG2酶活力的影响 | 第59-60页 |
| 3.1.6.5 内切葡聚糖酶EG2的热稳定性 | 第60页 |
| 3.2 嗜热毛壳菌外切纤维二糖水解酶CBH3的分子改造 | 第60-73页 |
| 3.2.1 同源建模确定突变位点 | 第60-63页 |
| 3.2.2 嗜热毛壳菌外切纤维二糖水解酶CBH3氨基酸的定点突变 | 第63-64页 |
| 3.2.3 酵母工程菌突变菌株的构建 | 第64-65页 |
| 3.2.4 五个突变酶的诱导表达及纯化 | 第65-67页 |
| 3.2.5 五个突变酶的蛋白电泳 | 第67页 |
| 3.2.6 外切纤维二糖水解酶CBH3及其突变蛋白酶学性质的研究 | 第67-73页 |
| 3.2.6.1 外切纤维二糖水解酶CBH3水解CMC的产物鉴定 | 第67-68页 |
| 3.2.6.2 外切纤维二糖水解酶CBH3及其突变蛋白酶活力测定 | 第68-69页 |
| 3.2.6.3 温度对外切纤维二糖水解酶CBH3及其突变蛋白酶活性的影响 | 第69-70页 |
| 3.2.6.4 pH对外切纤维二糖水解酶CBH3及其突变蛋白酶活性的影响 | 第70-71页 |
| 3.2.6.5 外切纤维二糖水解酶CBH3及其突变蛋白酶的热稳定性 | 第71-73页 |
| 4.讨论与建议 | 第73-76页 |
| 4.1 定点突变技术对蛋白的分子改造 | 第73页 |
| 4.2 同源建模预测蛋白三维结构 | 第73-74页 |
| 4.3 CBH3中底物结合关键氨基酸的初步筛选 | 第74-76页 |
| 5 结论 | 第76-77页 |
| 参考文献 | 第77-81页 |
| 致谢 | 第81页 |
