| 摘要 | 第1-4页 |
| Summary | 第4-10页 |
| 缩略词英汉对照表 | 第10-11页 |
| 第一章 绪论 | 第11-20页 |
| 1 猪流行性腹泻病毒简介 | 第11-13页 |
| ·PEDV 的分类、形态与基因组结构 | 第11-12页 |
| ·分类与形态特征 | 第11-12页 |
| ·病毒的基因组结构 | 第12页 |
| ·PEDV 的理化特性 | 第12-13页 |
| ·PEDV 的细胞培养特性 | 第13页 |
| 2 PEDV 基因分型 | 第13-14页 |
| 3 PEDV 流行病学调查 | 第14页 |
| 4 PEDV 编码蛋白及其功能 | 第14-16页 |
| ·PEDV 的非结构蛋白 | 第14-15页 |
| ·复制酶多聚蛋白 lab(pplab) | 第14页 |
| ·ORF3 及其编码的蛋白 | 第14-15页 |
| ·PEDV 的结构蛋白及其功能 | 第15-16页 |
| ·S 基因和 S 蛋白功能 | 第15页 |
| ·E 基因和 E 蛋白功能 | 第15页 |
| ·M 基因和 M 蛋白功能 | 第15页 |
| ·N 基因和 N 蛋白功能 | 第15-16页 |
| 5 PED 诊断技术 | 第16-18页 |
| ·ELISA 法 | 第16页 |
| ·微量血清中和试验 | 第16-17页 |
| ·免疫电镜法 | 第17页 |
| ·免疫荧光法 | 第17页 |
| ·RT-PCR 法 | 第17页 |
| ·RFLP 分析 | 第17-18页 |
| ·胶体金技术 | 第18页 |
| 6 研究目的及意义 | 第18页 |
| 7 研究内容和方法 | 第18-20页 |
| ·研究内容 | 第18页 |
| ·研究方法 | 第18-20页 |
| 第二章 2010～2013 年浙江省 PEDV 临床检测及 S1 基因遗传变异分析 | 第20-28页 |
| 1 材料与方法 | 第20-23页 |
| ·试验材料 | 第20-21页 |
| ·病料样品 | 第20页 |
| ·病料来源 | 第20页 |
| ·试剂 | 第20页 |
| ·仪器设备 | 第20-21页 |
| ·引物设计与合成 | 第21页 |
| ·试验方法 | 第21-23页 |
| ·临床样品的处理 | 第21页 |
| ·临床样品中病毒 RNA 的提取 | 第21页 |
| ·PEDV S1 基因片段的扩增和纯化 | 第21-22页 |
| ·S1 片段的扩增 | 第21页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳扩增 PCR 产物电泳 | 第21-22页 |
| ·胶回收 PCR 产物 | 第22页 |
| ·胶回收产物的连接 | 第22页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第22页 |
| ·阳性克隆的筛选 | 第22-23页 |
| ·序列测定 | 第23页 |
| ·S1 基因核苷酸序列的变异分析 | 第23页 |
| ·S1 基因推导的氨基酸序列变异分析 | 第23页 |
| ·基因推导氨基酸序列的差异研究 | 第23页 |
| 2 结果 | 第23-26页 |
| ·临床病科PEDV检测结果 | 第23-24页 |
| ·浙江省不同年份 PEDV 检出率的动态变化 | 第23页 |
| ·浙江省不同月份 PEDV 检出率的动态变化 | 第23-24页 |
| ·不同地区 PEDV 检出结果比较 | 第24页 |
| ·PEDV-S1 基因分析结果 | 第24-26页 |
| ·PEDV-S1 基因 5′端的 RT- PCR 的扩增结果 | 第24页 |
| ·S1 部分基因的系统进化树分析 | 第24页 |
| ·PEDV-S1 氨基酸序列分析 | 第24-25页 |
| ·浙江省测序毒株与国内外毒株序列 S1 基因遗传演化关系 | 第25-26页 |
| 3 讨论 | 第26-28页 |
| 第三章 PEDVS 基因部分片段的原核表达 | 第28-38页 |
| 1 材料 | 第28-29页 |
| ·载体与菌种及血清 | 第28页 |
| ·主要试剂 | 第28页 |
| ·主要仪器 | 第28-29页 |
| 2 方法 | 第29-35页 |
| ·引物合成 | 第29页 |
| ·RT-PCR 扩增目的片段 | 第29页 |
| ·PCR 产物回收纯化 | 第29页 |
| ·胶回收产物的连接 | 第29页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第29页 |
| ·连接产物的转化 | 第29-30页 |
| ·重组质粒的大量提取 | 第30-31页 |
| ·酶切产物的回收 | 第31页 |
| ·目的基因与表达载体的连接 | 第31页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第31-32页 |
| ·E.coli Top10 和 Rosseta 感受态细胞的制备 | 第31页 |
| ·重组质粒的转化 | 第31页 |
| ·重组质粒的大量提取 | 第31页 |
| ·重组质粒的测序 | 第31-32页 |
| ·阳性质粒转化入大肠杆菌 ROSETTA | 第32页 |
| ·重组蛋白的小量诱导 | 第32页 |
| ·SDS-PAGE 电泳鉴定 | 第32页 |
| ·WESTERN-BLOT 鉴定抗原性 | 第32-33页 |
| ·重组蛋白表达时间的优化 | 第33页 |
| ·重组蛋白溶解性的判定 | 第33页 |
| ·重组蛋白的大量诱导和纯化 | 第33-35页 |
| 3 结果 | 第35-37页 |
| ·S 基因的 PCR 扩增 | 第35页 |
| ·重组蛋白的 SDS-PAGE 鉴定 | 第35页 |
| ·WESTERN BLOT 鉴定重组蛋白反应原性 | 第35页 |
| ·重组蛋白表达时间的优化 | 第35页 |
| ·重组蛋白溶解性的判定 | 第35-36页 |
| ·重组蛋白的纯化 | 第36-37页 |
| 4 讨论 | 第37-38页 |
| 第四章 PEDV 间接 ELISA 抗体检测方法的建立与应用 | 第38-46页 |
| 1 材料与方法 | 第38-39页 |
| ·试验材料与仪器 | 第38页 |
| ·间接 ELISA 方法的操作程序 | 第38-39页 |
| 2 间接 ELISA 方法的条件优化 | 第39-40页 |
| ·抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的确定 | 第39页 |
| ·抗原包被时间的选择 | 第39页 |
| ·最佳封闭液的优化 | 第39页 |
| ·封闭液封闭时间的优化 | 第39页 |
| ·血清最佳反应时间的优化 | 第39页 |
| ·二抗最佳稀释倍数及反应时间的优化 | 第39-40页 |
| ·底物最佳反应时间的确定 | 第40页 |
| ·阴阳性临界值的确定 | 第40页 |
| ·特异性分析 | 第40页 |
| ·重复性实验 | 第40页 |
| ·批内重复性实验 | 第40页 |
| ·批间重复性实验 | 第40页 |
| ·临床应用 | 第40页 |
| 3 结果 | 第40-45页 |
| ·抗原最佳包被浓度及血清最佳稀释度的选择 | 第41页 |
| ·最佳抗原包被时间的优化 | 第41-42页 |
| ·最佳封闭液的选择 | 第42页 |
| ·封闭液封闭时间的确定 | 第42页 |
| ·血清作用时间的优化 | 第42页 |
| ·酶标二抗作用浓度和时间的优化 | 第42-43页 |
| ·底物最佳反应时间的确定 | 第43页 |
| ·阴阳性临界值的确定 | 第43页 |
| ·特异性分析 | 第43-44页 |
| ·重复性检测结果 | 第44页 |
| ·间接 ELISA 抗体检测方法临床应用结果 | 第44-45页 |
| ·浙江省规模猪场血清样本 PEDV 抗体的检测 | 第44页 |
| ·同一猪场发病仔猪与不发病仔猪的母猪血清抗体 ELISA 检测结果比较 | 第44-45页 |
| 4 讨论 | 第45-46页 |
| 全文结论 | 第46-47页 |
| 致谢 | 第47-48页 |
| 参考文献 | 第48-53页 |
| 附录 常用缓冲液及溶液配制 | 第53-54页 |
| 作者简介 | 第54-55页 |
| 导师简介 | 第55-56页 |
