| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-12页 |
| 第1章 文献综述 | 第12-25页 |
| ·研究背景 | 第12-22页 |
| ·酪氨酸激酶的功能与癌症治疗 | 第12-18页 |
| ·表皮生长因子受体 | 第14-15页 |
| ·β型血小板衍生生长因子受体 | 第15-17页 |
| ·非受体型酪氨酸激酶 | 第17-18页 |
| ·蛋白酪氨酸磷酸酶 | 第18-20页 |
| ·毕赤酵母表达系统的发展及其优点 | 第20-21页 |
| ·过氧化物酶体 | 第21页 |
| ·绿色荧光蛋白 | 第21-22页 |
| ·酪氨酸磷酸酶及酪氨酸激酶共表达 | 第22-24页 |
| ·本课题的研究内容及意义 | 第24-25页 |
| 第2章 重组毕赤酵母PTP1B表达菌株的构建 | 第25-43页 |
| ·前言 | 第25页 |
| ·实验材料 | 第25-26页 |
| ·菌种与质粒 | 第25页 |
| ·试剂及试剂盒 | 第25-26页 |
| ·培养基 | 第26页 |
| ·仪器设备 | 第26页 |
| ·实验方法 | 第26-31页 |
| ·PTP1B重组表达载体的构建 | 第26-30页 |
| ·大肠杆菌TOP 10感受态细胞的制备及转化 | 第27-28页 |
| ·带有PTP1B序列的重组质粒的构建 | 第28-29页 |
| ·pAG32S-PTP1B与pAG32S-PTP1B-SKL质粒转化入大肠杆菌TOP 10 | 第29页 |
| ·质粒pAG32S-BFP-PTP1B与pAG32S-BFP-PTP1B-SKL的构建 | 第29-30页 |
| ·重组表达PTP1B的宿主菌构建 | 第30-31页 |
| ·结果与讨论 | 第31-42页 |
| ·重组表达载体pPIC3.5-PTP1B、pPIC3.5-PTP1B-SKL的构建 | 第31-33页 |
| ·重组表达载体pAG32S-PTP1B、pAG32S-PTP1B-SKL的构建 | 第33-36页 |
| ·含有绿色荧光蛋白的重组表达载体的构建 | 第36-37页 |
| ·重组毕赤酵母PTP1B表达菌株的构建与筛选 | 第37-42页 |
| ·重组表达载体的线性化 | 第40页 |
| ·转化与筛选 | 第40-42页 |
| ·本章小结 | 第42-43页 |
| 第3章 PDGFRβ、EGFR-2与c-Src表达质粒的构建 | 第43-64页 |
| ·前言 | 第43页 |
| ·实验材料 | 第43页 |
| ·实验方法 | 第43-47页 |
| ·PDGFRp和EGFR-2重组表达载体的构建 | 第43-45页 |
| ·带有c-Src序列的重组质粒的构建 | 第45页 |
| ·表达PDGFRβ、EGFR-2与c-Src重组宿主菌的构建 | 第45-47页 |
| ·载体的线性化 | 第46页 |
| ·感受态制备及电穿孔转化 | 第46页 |
| ·G418筛选高拷贝菌株 | 第46-47页 |
| ·重组子鉴定 | 第47页 |
| ·蓝与绿色荧光标记过氧化物酶体菌株的构建 | 第47页 |
| ·结果与讨论 | 第47-63页 |
| ·重组表达载体pPIC3.5-GFP-PDGFRβ-SKL、pPIC3.5-GFP-EGFR2-SKL的构建 | 第47页 |
| ·PDGFRβ与EGFR-2基因的扩增 | 第47页 |
| ·pPIC3.5-PDGFRβ-SKL与pPIC3.5-EGFR2-SKL载体的构建 | 第47页 |
| ·重组表达载体pPIC3.5-GFP-c-Src的构建 | 第47-50页 |
| ·c-Src基因的扩增 | 第48-50页 |
| ·pPIC3.5-His-GFP-c-Src(pPIC3.5-GFP-c-Src)载体的构建 | 第50页 |
| ·质粒转入TOP 10大肠杆菌 | 第50-51页 |
| ·重组毕赤酵母EGFR-2、PDGFRβ与c-Src表达菌株的构建与筛选 | 第51-63页 |
| ·重组表达载体的线性化 | 第51-52页 |
| ·毕赤酵母转化子HIS~+Mut~+型鉴定及G418筛选 | 第52-53页 |
| ·毕赤酵母转化子PCR验证 | 第53-56页 |
| ·BFP与GFP荧光检测验证表达 | 第56-62页 |
| ·毕赤酵母PDGFRβ、EGFR-2和c-Src分别与GFP的共表达 | 第62-63页 |
| ·本章小结 | 第63-64页 |
| 第4章 酪氨酸激酶EGFR-2表达、纯化及活性分析 | 第64-81页 |
| ·前言 | 第64页 |
| ·实验材料 | 第64-65页 |
| ·菌种 | 第64页 |
| ·仪器设备 | 第64页 |
| ·试剂、介质和溶液 | 第64-65页 |
| ·实验方法 | 第65-71页 |
| ·EGFR-2重组表达宿主菌的摇瓶筛选 | 第65页 |
| ·分析方法 | 第65-68页 |
| ·流式细胞仪检测融合蛋白相对荧光强度 | 第65页 |
| ·EGFR-2蛋白质定量 | 第65-66页 |
| ·聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第66-67页 |
| ·Western-blotting蛋白免疫印迹检测 | 第67-68页 |
| ·融合蛋白His-GFP-EGFR2的分离纯化 | 第68-69页 |
| ·发酵菌体的破壁 | 第68页 |
| ·离子交换层析 | 第68-69页 |
| ·镍亲和柱层析 | 第69页 |
| ·EGFR-2融合蛋白活性及抑制率检测 | 第69-71页 |
| ·EGFR-2蛋白的催化底物磷酸化能力分析 | 第70页 |
| ·蛋白抑制剂分子水平筛选模型的建立 | 第70-71页 |
| ·结果与讨论 | 第71-80页 |
| ·摇瓶表达和荧光检测 | 第71-73页 |
| ·EGFR-2融合蛋白的分离纯化 | 第73-76页 |
| ·酶联免疫检测激酶活性 | 第76-78页 |
| ·EGFR-2抑制剂筛选模型的建立 | 第78-80页 |
| ·EGF-2融合蛋白的催化底物磷酸化的能力分析 | 第78页 |
| ·ATP浓度对EGFR-2融合蛋白磷酸化反应的影响 | 第78-80页 |
| ·本章小结 | 第80-81页 |
| 第5章 酪氨酸激酶PDGFRβ的表达、纯化及活性分析 | 第81-88页 |
| ·前言 | 第81页 |
| ·实验材料 | 第81页 |
| ·试验方法 | 第81页 |
| ·结果与讨论 | 第81-87页 |
| ·摇瓶表达和荧光检测 | 第81-83页 |
| ·PDGFRβ融合蛋白的分离纯化 | 第83-86页 |
| ·酶联免疫检测激酶活性 | 第86页 |
| ·PDGFRβ抑制剂筛选模型的建立 | 第86-87页 |
| ·本章小结 | 第87-88页 |
| 第6章 酪氨酸激酶c-Src表达、纯化及活性分析 | 第88-97页 |
| ·前言 | 第88页 |
| ·实验材料 | 第88页 |
| ·实验方法 | 第88-89页 |
| ·c-Src重组表达宿主菌的摇瓶表达筛选 | 第88-89页 |
| ·商用抑制剂PP2对c-Src筛选模型的检验 | 第89页 |
| ·结果与讨论 | 第89-95页 |
| ·摇瓶表达和荧光检测 | 第89-90页 |
| ·c-Src融合蛋白的分离纯化 | 第90-93页 |
| ·酶联免疫检测激酶活性 | 第93-94页 |
| ·c-Src抑制剂筛选模型的建立 | 第94-95页 |
| ·c-Src融合蛋白的催化底物磷酸化的能力分析 | 第94页 |
| ·抑制剂PP2对c-Src酪氨酸激酶的作用 | 第94-95页 |
| ·本章小结 | 第95-97页 |
| 第7章 结论与展望 | 第97-99页 |
| ·结论 | 第97页 |
| ·创新点 | 第97页 |
| ·展望 | 第97-99页 |
| 参考文献 | 第99-109页 |
| 致谢 | 第109页 |
