| 摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-18页 |
| 第一章 绪论 | 第18-32页 |
| ·研究目的和意义 | 第18-19页 |
| ·国内外研究进展 | 第19-30页 |
| ·微生物蛋白酶的研究 | 第19-23页 |
| ·微生物蛋白酶的种类 | 第19-20页 |
| ·丝氨酸蛋白酶 | 第20-21页 |
| ·半胱氨酸蛋白酶 | 第21页 |
| ·天冬氨酸蛋白酶 | 第21-22页 |
| ·金属蛋白酶 | 第22-23页 |
| ·肽酶 | 第23页 |
| ·瘤胃微生物蛋白质降解和微生物合成之间的关系 | 第23-27页 |
| ·细菌蛋白酶降解日粮蛋白成寡肽 | 第25-26页 |
| ·细菌肽酶降解寡肽成氨基酸 | 第26页 |
| ·细菌脱氨酶降解氨基酸成氨 | 第26-27页 |
| ·细菌在非蛋白氮降解中的作用 | 第27页 |
| ·元基因组学研究 | 第27-30页 |
| ·功能驱动筛选法 | 第28-29页 |
| ·序列驱动筛选法 | 第29页 |
| ·瘤胃微生物的元基因组学筛选 | 第29-30页 |
| ·研究内容 | 第30-32页 |
| 第二章 瘤胃微生物 Fosmid 文库蛋白酶阳性克隆的筛选与序列分析 | 第32-47页 |
| ·材料与方法 | 第32-35页 |
| ·奶牛瘤胃 Fosmid 文库的构建 | 第32-33页 |
| ·瘤胃 Fosmid 文库的复制 | 第33页 |
| ·蛋白酶阳性克隆筛选与验证 | 第33页 |
| ·蛋白酶选择性培养基的配制 | 第33页 |
| ·蛋白酶阳性克隆筛选 | 第33页 |
| ·阳性克隆蛋白酶活力测定 | 第33-34页 |
| ·阳性克隆蛋白酶提取 | 第33页 |
| ·阳性克隆蛋白酶活性测定 | 第33-34页 |
| ·阳性克隆 Fosmid 末端序列测定 | 第34页 |
| ·阳性克隆插入序列测序 | 第34-35页 |
| ·阳性克隆的质粒提取 | 第34页 |
| ·阳性克隆的插入序列分析 | 第34-35页 |
| ·结果与分析 | 第35-43页 |
| ·瘤胃 Fosmid 文库的复制结果 | 第35页 |
| ·蛋白酶阳性克隆的筛选 | 第35-36页 |
| ·脱脂乳粉培养基的筛选 | 第35页 |
| ·大豆蛋白粉培养基的筛选 | 第35-36页 |
| ·蛋白酶阳性克隆酶活性测定 | 第36-37页 |
| ·蛋白酶阳性克隆的末端序列分析 | 第37-39页 |
| ·阳性克隆插入片段的序列特征 | 第39-43页 |
| ·讨论 | 第43-46页 |
| ·蛋白酶阳性克隆的筛选 | 第43-44页 |
| ·阳性克隆酶活性分析 | 第44页 |
| ·阳性克隆末端序列的分析 | 第44-45页 |
| ·阳性克隆插入序列的分析 | 第45-46页 |
| ·结论 | 第46-47页 |
| 第三章 瘤胃微生物 Fosmid 文库中二肽基肽酶Ⅳ的筛选与分析 | 第47-63页 |
| ·材料与方法 | 第47-51页 |
| ·瘤胃微生物 Fosmid 文库筛选池的制备 | 第47-48页 |
| ·Fosmid 文库混合质粒的提取 | 第48-49页 |
| ·DPP-Ⅳ阳性克隆的序列性筛选 | 第49页 |
| ·二级筛选池中 DPP-Ⅳ的 PCR 扩增 | 第49页 |
| ·含 DPP-Ⅳ基因阳性克隆的追溯 | 第49页 |
| ·阳性克隆的验证 | 第49页 |
| ·阳性克隆的酶切鉴定 | 第49页 |
| ·阳性克隆 Fosmid 末端序列测定 | 第49页 |
| ·阳性克隆 DPP-Ⅳ基因的克隆和测序 | 第49-50页 |
| ·阳性克隆混合质粒的高通量测序 | 第50页 |
| ·阳性克隆肽酶活性测定 | 第50-51页 |
| ·阳性克隆粗酶液的提取 | 第50页 |
| ·阳性克隆肽酶活性测定 | 第50-51页 |
| ·结果与分析 | 第51-60页 |
| ·阳性克隆的序列性筛选 | 第51-52页 |
| ·阳性克隆的酶切鉴定 | 第52页 |
| ·阳性克隆的末端测序 | 第52-54页 |
| ·DPP-Ⅳ序列的多样性分析 | 第54页 |
| ·Fosmid 克隆中插入序列的分析 | 第54-59页 |
| ·阳性克隆肽酶活性测定 | 第59-60页 |
| ·讨论 | 第60-62页 |
| ·DPP-Ⅳ基因的混合质粒筛选 | 第60-61页 |
| ·DPP-Ⅳ基因的序列分析 | 第61页 |
| ·阳性克隆插入序列的分析 | 第61-62页 |
| ·阳性克隆肽酶活性分析 | 第62页 |
| ·结论 | 第62-63页 |
| 第四章 DP7 克隆中二肽基肽酶Ⅳ的表达 | 第63-76页 |
| ·材料与方法 | 第64-66页 |
| ·材料来源 | 第64页 |
| ·DPP-Ⅳ基因序列的获得和分析 | 第64页 |
| ·DPP-Ⅳ基因序列的获得 | 第64页 |
| ·DPP-Ⅳ序列的分析 | 第64页 |
| ·DP7 中 DPP-Ⅳ的表达和纯化 | 第64-66页 |
| ·DP7 中 DPP-Ⅳ表达序列扩增 | 第64-65页 |
| ·DP7-DPP-Ⅳ克隆和 pET28a 载体的双酶切和连接 | 第65-66页 |
| ·pET28a-DPP-Ⅳ目的蛋白的诱导表达 | 第66页 |
| ·pET28a-DPP-Ⅳ目的蛋白的提取 | 第66页 |
| ·pET28a-DPP-Ⅳ目的蛋白的纯化 | 第66页 |
| ·结果与分析 | 第66-74页 |
| ·DPP-Ⅳ序列的分析 | 第66-70页 |
| ·DPP-Ⅳ序列组成和理化性质 | 第66-67页 |
| ·DPP-Ⅳ序列信号肽的预测与分析 | 第67页 |
| ·DPP-Ⅳ序列跨膜结构的预测与分析 | 第67-68页 |
| ·DPP-Ⅳ序列疏水性的预测与分析 | 第68页 |
| ·DPP-Ⅳ序列保守结构域的预测与分析 | 第68-69页 |
| ·DPP-Ⅳ序列的进化分析 | 第69-70页 |
| ·DPP-Ⅳ基因的表达产物扩增 | 第70-71页 |
| ·pET28a 载体和 DPP-Ⅳ基因表达产物的双酶切体系的建立 | 第71-72页 |
| ·pET28a 载体和 DPP-Ⅳ基因表达产物的连接 | 第72-73页 |
| ·pET28a-DPP-Ⅳ目的蛋白的表达与纯化 | 第73-74页 |
| ·讨论 | 第74-75页 |
| ·结论 | 第75-76页 |
| 第五章 豆粕降解菌中二肽基肽酶Ⅳ的序列分析 | 第76-87页 |
| ·材料与方法 | 第76-78页 |
| ·样品采集 | 第76页 |
| ·总 DNA 提取 | 第76-77页 |
| ·16S rDNA V3 区域 PCR 扩增 | 第77页 |
| ·变性梯度凝胶电泳 | 第77页 |
| ·DPP-Ⅳ基因的 PCR 扩增 | 第77-78页 |
| ·DPP-Ⅳ基因序列克隆和测序 | 第78页 |
| ·DPP-Ⅳ基因的序列分析 | 第78页 |
| ·结果与分析 | 第78-84页 |
| ·不同时间点豆粕降解菌 DNA 提取 | 第78页 |
| ·不同时间点豆粕降解菌 16S rDNA 的 PCR-DGGE 分析 | 第78-79页 |
| ·DPP-Ⅳ基因部分序列的扩增和序列分析 | 第79-81页 |
| ·DPP-Ⅳ全长基因的扩增和序列分析 | 第81-84页 |
| ·讨论 | 第84-86页 |
| ·豆粕收集菌的多样性分析 | 第84-85页 |
| ·DPP-Ⅳ基因部分序列的分析 | 第85页 |
| ·DPP-Ⅳ全长基因的序列分析 | 第85-86页 |
| ·结论 | 第86-87页 |
| 第六章 体外培养条件下二肽基肽酶Ⅳ的序列分析 | 第87-99页 |
| ·材料与方法 | 第88-90页 |
| ·厌氧培养基的配制 | 第88页 |
| ·厌氧菌的富集培养和样品采集 | 第88-89页 |
| ·DPP-Ⅳ基因的扩增 | 第89页 |
| ·DPP-Ⅳ基因的克隆、测序和分析 | 第89页 |
| ·DPP-Ⅳ基因的定量分析 | 第89-90页 |
| ·DPP-Ⅳ基因定量引物的设计和扩增 | 第89页 |
| ·DPP-Ⅳ基因荧光定量标准品的制备 | 第89-90页 |
| ·DPP-Ⅳ基因标准曲线的建立和样品检测 | 第90页 |
| ·数据处理 | 第90页 |
| ·结果与分析 | 第90-97页 |
| ·厌氧培养样品中 DPP-Ⅳ基因的序列分析 | 第90-95页 |
| ·厌氧培养样品中 DPP-Ⅳ基因的定量 | 第95-97页 |
| ·DPP-Ⅳ基因定量引物的 PCR 扩增 | 第95页 |
| ·DPP-Ⅳ基因标准品制备及标准曲线建立 | 第95-96页 |
| ·厌氧培养样品中 DPP-Ⅳ基因的表达 | 第96-97页 |
| ·讨论 | 第97-98页 |
| ·结论 | 第98-99页 |
| 第七章 全文结论 | 第99-101页 |
| ·全文结论 | 第99页 |
| ·创新点 | 第99-100页 |
| ·有待进一步研究的问题 | 第100-101页 |
| 参考文献 | 第101-119页 |
| 附录 | 第119-120页 |
| 致谢 | 第120-121页 |
| 作者简历 | 第121页 |
