| 中文摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-9页 |
| 目录 | 第9-14页 |
| 第一部分 文献综述 | 第14-31页 |
| 1 GH/IGF 轴及其调控机理 | 第14-24页 |
| ·GH/IGF 轴的组成与功能 | 第14-19页 |
| ·GH 及其结构与功能 | 第15-16页 |
| ·GHR 及其结构与功能 | 第16-17页 |
| ·IGF-I 及其结构与功能 | 第17-19页 |
| ·介导 GH/IGF 轴作用的 JAK-STAT 信号通路 | 第19-23页 |
| ·JAK-STAT 信号通路中 JAK 的结构与功能 | 第20页 |
| ·JAK-STAT 信号通路中 STAT 的结构与功能 | 第20-22页 |
| ·JAK-STAT 信号通路的正向调控作用 | 第22页 |
| ·JAK-STAT 信号通路的负向调控子 | 第22-23页 |
| ·GH 通过 STAT 的介导促进 IGF-I 基因的表达 | 第23-24页 |
| 2 检测转录因子与 DNA 结合的主要实验技术 | 第24-29页 |
| ·体内研究方法 | 第24-26页 |
| ·非变性染色质免疫沉淀(nChIP) | 第25页 |
| ·变性(交联)染色质免疫沉淀(xChIP) | 第25页 |
| ·ChIP-on-chip | 第25-26页 |
| ·Re-ChIP | 第26页 |
| ·ChIP Chop | 第26页 |
| ·体外研究方法 | 第26-28页 |
| ·电泳迁移率变动实验 | 第26-27页 |
| ·足迹法 | 第27页 |
| ·Southwestern 杂交 | 第27-28页 |
| ·硝化纤维膜过滤实验 | 第28页 |
| ·保护实验/干扰实验 | 第28页 |
| ·其他新技术 | 第28-29页 |
| 3 研究展望 | 第29页 |
| 4 本实验的目的及意义 | 第29-31页 |
| 第二部分 材料与方法 | 第31-56页 |
| 1 实验材料 | 第31-40页 |
| ·实验样品 | 第31页 |
| ·实验器材 | 第31-32页 |
| ·实验试剂 | 第32-33页 |
| ·缓冲液和常用试剂的配置 | 第33-35页 |
| ·引物设计与合成 | 第35-40页 |
| 2 实验方法 | 第40-56页 |
| ·检测鸡原代肝细胞中 IGF-I mRNA 实验 | 第40-43页 |
| ·鸡肝细胞的分离 | 第40-41页 |
| ·鸡肝细胞的原代培养 | 第41页 |
| ·GH 处理鸡肝细胞 | 第41-42页 |
| ·提取鸡肝细胞总 RNA | 第42页 |
| ·荧光定量 PCR | 第42-43页 |
| ·反转录反应(SYBR Green Assay) | 第42-43页 |
| ·荧光定量 PCR 反应 | 第43页 |
| ·STAT5b 结合位点的预测 | 第43-44页 |
| ·数据分析网站 | 第43页 |
| ·数据分析软件 | 第43-44页 |
| ·鸡血基因组 DNA 的提取 | 第44页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第44-45页 |
| ·载体的构建 | 第45-49页 |
| ·PCR 反应 | 第45页 |
| ·PCR 产物回收 | 第45-46页 |
| ·PCR 产物与载体的酶切反应 | 第46-47页 |
| ·连接反应 | 第47页 |
| ·转化实验 | 第47页 |
| ·PCR 方法鉴定 | 第47-48页 |
| ·连接产物的质粒回收 | 第48页 |
| ·重组质粒的酶切鉴定 | 第48-49页 |
| ·细胞转染实验 | 第49-51页 |
| ·细胞转染用质粒的提取 | 第49-50页 |
| ·细胞系的培养和传代 | 第50页 |
| ·CHO 细胞的冻存和复苏 | 第50-51页 |
| ·细胞共转染实验 | 第51页 |
| ·荧光素酶测定方法 | 第51页 |
| ·ChIP 实验技术 | 第51-56页 |
| ·GH 处理鸡原代肝细胞 | 第51-52页 |
| ·细胞交联 | 第52页 |
| ·超声 | 第52-53页 |
| ·免疫沉淀 | 第53页 |
| ·磁珠洗涤 | 第53页 |
| ·染色质洗涤、逆转交联及蛋白酶 K 处理 | 第53-54页 |
| ·DNA 纯化(使用天根琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒) | 第54-55页 |
| ·荧光定量 PCR | 第55-56页 |
| 第三部分 结果与分析 | 第56-82页 |
| 1 GH 能够促进鸡肝细胞中 IGF-I mRNA 的表达 | 第56-57页 |
| 2 STAT5b 结合位点的预测结果 | 第57-61页 |
| ·鸡 IGF-I 基因及其侧翼区序列上的 STAT5b 结合位点 | 第57-60页 |
| ·保守的 STAT5b 结合位点 | 第60-61页 |
| 3 体外细胞培养实验系统验证 STAT5b 结合位点的增强子作用 | 第61-78页 |
| ·保守 STAT5b 结合位点的增强子作用的验证 | 第61-65页 |
| ·保守 STAT5b 结合位点介导 GH 促进报告基因的表达 | 第61-62页 |
| ·GH 促进报告基因表达依赖于 S26 STAT5b 结合位点 | 第62-64页 |
| ·保守位点 S26 促进报告基因表达依赖于 STAT5b 蛋白 | 第64-65页 |
| ·能够与组成型活化的 STAT5b 蛋白结合的其他结合位点 | 第65-72页 |
| ·鸡 IGF-I 基因上游 5'端序列与组成型活化的 STAT5b 蛋白结合的STAT5b 结合位点的验证 | 第65-67页 |
| ·鸡 IGF-I 基因内含子 1 上与组成型活化的 STAT5b 蛋白结合的STAT5b 结合位点的验证 | 第67-68页 |
| ·鸡 IGF-I 基因内含子 2 上与组成型活化的 STAT5b 蛋白结合的STAT5b 结合位点的验证 | 第68-69页 |
| ·鸡 IGF-I 基因内含子 3 上与组成型活化的 STAT5b 蛋白结合的STAT5b 结合位点的验证 | 第69-71页 |
| ·鸡 IGF-I 基因下游 3'端序列与组成型活化的 STAT5b 蛋白结合的STAT5b 结合位点的验证 | 第71-72页 |
| ·能够介导 GH 促进报告基因表达的 STAT5b 结合位点的验证 | 第72-73页 |
| ·GH 促进报告基因表达依赖于 STAT5b 结合位点的验证 | 第73-78页 |
| ·STAT5b 结合位点突变载体的构建 | 第73-75页 |
| ·GH 促进报告基因表达依赖于 STAT5b 结合位点 | 第75-78页 |
| 4 ChIP 实验验证 STAT5b 结合位点的增强子作用 | 第78-82页 |
| ·GH 能够促进 STAT5b 蛋白与保守位点 S26 结合 | 第78-79页 |
| ·STAT5b 蛋白与 IGF-I 基因上其他位点结合的检测分析 | 第79-82页 |
| 第四部分 讨论 | 第82-91页 |
| 1 鸡肝细胞的体外培养 | 第82页 |
| 2 GH 促进 IGF-I 基因的表达 | 第82-83页 |
| ·GH 剂量的选择 | 第82-83页 |
| ·GH 促进 IGF-I 基因表达的途径 | 第83页 |
| 3 体外实验验证鸡 IGF-I 基因及其侧翼区序列上 STAT5b 结合位点的增强子作用 | 第83-87页 |
| ·增强子 | 第84页 |
| ·能够与组成型活化的 STAT5b 蛋白结合的结合位点 | 第84-85页 |
| ·能够介导 GH 促进报告基因表达的 STAT5b 结合位点 | 第85页 |
| ·GH 刺激报告基因表达依赖于 STAT5b 结合位点 | 第85-86页 |
| ·STAT5b 位点促进报告基因表达依赖于 STAT5b 蛋白 | 第86-87页 |
| 4 ChIP 实验验证起增强子作用的 STAT5b 结合位点 | 第87-88页 |
| 5 实验中的一些注意事项 | 第88-89页 |
| ·鸡肝细胞分离培养 | 第88页 |
| ·突变引物的设计 | 第88页 |
| ·荧光素酶报告基因检测实验 | 第88-89页 |
| ·ChIP 实验 | 第89页 |
| 6 展望 | 第89-91页 |
| 第五部分 结论 | 第91-92页 |
| 参考文献 | 第92-103页 |
| 附录 | 第103-109页 |
| 攻读学位期间本人出版或公开发表的论著、论文 | 第109-110页 |
| 致谢 | 第110-111页 |
