| 目录 | 第1-9页 |
| 中文摘要 | 第9-12页 |
| 1.中国五指山猪中PERV存在与表达情况的调查 | 第9-10页 |
| 2.对PERV 5’非编码区启动子活性的分析 | 第10页 |
| 3.基于PERV长末端重复序列的逆转录病毒载体的构建 | 第10-12页 |
| Abstract | 第12-15页 |
| 缩略词(Abbreviation) | 第15-17页 |
| 第一部分 猪内源性反转录病毒的研究进展(综述) | 第17-32页 |
| 1 PERV分子生物学特性的研究 | 第17-25页 |
| ·PERV的生活周期 | 第17-18页 |
| ·PERV的形态学特征 | 第18-19页 |
| ·PERV的基因组结构及功能 | 第19-21页 |
| ·PERV基因组编码的蛋白质及功能 | 第21-25页 |
| ·核心蛋白(gag) | 第21-23页 |
| ·酶蛋白(pol) | 第23-24页 |
| ·囊膜蛋白(env) | 第24-25页 |
| 2 PERV的感染性与异种移植的安全性 | 第25-29页 |
| 3 PERV检测技术的研究进展 | 第29-31页 |
| ·病毒的分离与鉴定 | 第29页 |
| ·血清学诊断试验 | 第29-30页 |
| ·单克隆抗体技术 | 第30页 |
| ·分子生物学诊断技术 | 第30-31页 |
| 4 展望 | 第31-32页 |
| 第二部分 中国五指山猪中PERV存在与表达情况的调查 | 第32-43页 |
| 1 研究目的与意义 | 第33页 |
| 2 材料与方法 | 第33-37页 |
| ·材料 | 第33-34页 |
| ·检测样品 | 第33页 |
| ·工具酶和试剂 | 第33-34页 |
| ·主要仪器 | 第34页 |
| ·主要溶液配制 | 第34页 |
| ·外周血淋巴细胞的分离 | 第34页 |
| ·PBL DNA的制备 | 第34-35页 |
| ·细胞的消化 | 第34页 |
| ·核酸抽提与纯化 | 第34-35页 |
| ·PBL RNA的制备 | 第35页 |
| ·引物的设计与合成 | 第35-36页 |
| ·PCR扩增与分析 | 第36页 |
| ·RT-PCR反应与分析 | 第36-37页 |
| 3 结果 | 第37-40页 |
| ·中国五指山猪基因组中PERV亚型存在的检测 | 第37页 |
| ·PERV编码基因存在的检测 | 第37-38页 |
| ·PERV亚型表达的检测 | 第38-40页 |
| ·PERV编码基因表达的检测 | 第40页 |
| 4 讨论 | 第40-42页 |
| ·PERV的存在 | 第40-41页 |
| ·PERV的表达 | 第41-42页 |
| 5 结论 | 第42-43页 |
| 第三部分 猪内源性反转录病毒5’非编码区启动子活性的分析 | 第43-65页 |
| 1 研究目的与意义 | 第44页 |
| 2 材料与方法 | 第44-55页 |
| ·材料 | 第44-50页 |
| ·菌株与质粒 | 第45页 |
| ·细胞 | 第45页 |
| ·工具酶及主要试剂 | 第45页 |
| ·主要仪器 | 第45页 |
| ·主要溶液配制 | 第45-50页 |
| ·方法 | 第50-55页 |
| ·引物的设计与合成 | 第50页 |
| ·PCR扩增 | 第50-51页 |
| ·重组PCR | 第51页 |
| ·PCR产物的回收与纯化 | 第51页 |
| ·PCR产物的克隆 | 第51页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第51-52页 |
| ·连接产物及质粒的转化 | 第52页 |
| ·重组质粒的快速鉴定 | 第52页 |
| ·质粒的制备 | 第52-53页 |
| ·重组质粒外源片段插入方向的鉴定 | 第53页 |
| ·萤光素酶表达载体的构建 | 第53-54页 |
| ·纯化质粒及检测 | 第54页 |
| ·转染COS-7细胞 | 第54页 |
| ·萤光素酶报告基因检测 | 第54-55页 |
| 3 结果 | 第55-61页 |
| ·PCR扩增 | 第55页 |
| ·重组质粒的筛选和插入子方向的鉴定 | 第55-56页 |
| ·测序结果 | 第56-57页 |
| ·转录因子结合位点预测 | 第57-58页 |
| ·PGL3系列重组质粒的筛选 | 第58-59页 |
| ·各转染质粒浓度及纯度检测结果 | 第59页 |
| ·含有不同功能区的UTR的启动子活性 | 第59-61页 |
| 4 讨论 | 第61-64页 |
| ·PERV UTRs的结构 | 第61-62页 |
| ·WZSP-PERV的进化年龄 | 第62页 |
| ·R区 | 第62页 |
| ·U3重复区 | 第62-63页 |
| ·U3上游序列 | 第63页 |
| ·UTR的下游序列(PBS和前导序列) | 第63-64页 |
| 5 结论 | 第64-65页 |
| 第四部分 逆转录病毒载体研究进展(综述) | 第65-75页 |
| 1 逆转录病毒的生物学特性 | 第65-67页 |
| 2 逆转录病毒载体 | 第67-70页 |
| ·逆转录病毒载体的优点 | 第67页 |
| ·逆转录病毒载体的缺点 | 第67页 |
| ·逆转录病毒载体系统的构建 | 第67-70页 |
| 3 逆转录病毒载体的类型 | 第70-72页 |
| ·双表达载体 | 第70-71页 |
| ·VIP载体 | 第71页 |
| ·自我失活型载体 | 第71-72页 |
| ·非自动失活的定位表达载体 | 第72页 |
| 4 逆转录病毒载体的安全性 | 第72-73页 |
| 5 逆转录病毒载体的应用及前景 | 第73-75页 |
| 第五部分 基于猪内源性反转录病毒长末端重复序列的逆转录病毒载体的构建 | 第75-102页 |
| 1 研究目的与意义 | 第76-78页 |
| 2 材料与方法 | 第78-86页 |
| ·材料 | 第78-80页 |
| ·菌株与质粒 | 第78-79页 |
| ·工具酶及主要试剂 | 第79页 |
| ·主要仪器 | 第79页 |
| ·常用溶液配制 | 第79页 |
| ·Southern blotting试剂 | 第79-80页 |
| ·方法 | 第80-82页 |
| ·引物的设计与合成 | 第80-81页 |
| ·PCR扩增 | 第81-82页 |
| ·重组质粒MIGR1-5’UTR的构建 | 第82页 |
| ·载体MIGR1-PERV(pMP)的构建 | 第82页 |
| ·含neo基因的MIGR1-PERV-neo及MIGR1-neo载体(pMPN,pMN)的构建 | 第82页 |
| ·纯化质粒及检测 | 第82页 |
| ·转染PK-15细胞 | 第82-83页 |
| ·G418抗性筛选 | 第83页 |
| ·基因组DNA的提取 | 第83-84页 |
| ·基因组DNA的PCR检测 | 第84页 |
| ·Southern blotting检测 | 第84-85页 |
| ·酶切与电泳 | 第84页 |
| ·探针制备 | 第84页 |
| ·标记探针 | 第84-85页 |
| ·Southern印迹转移 | 第85页 |
| ·杂交 | 第85页 |
| ·洗膜 | 第85页 |
| ·显色反应 | 第85页 |
| ·pMPN和pMIGR1-5,UTR分别与包装质粒共转染HEK293-T细胞 | 第85-86页 |
| ·pMPN载体与包装质粒共转染PK-15细胞 | 第86页 |
| 3 结果 | 第86-97页 |
| ·扩增PERV 5’UTR,3’LTR,neo基因结果 | 第86-87页 |
| ·重组质粒MIGR1-5’UTR酶切鉴定结果 | 第87页 |
| ·pMP酶切鉴定结果 | 第87-88页 |
| ·pMPN及pMN酶切鉴定结果 | 第88-89页 |
| ·纯化质粒检测结果 | 第89页 |
| ·pMPN、pMN转染PK-15结果 | 第89-90页 |
| ·流式细胞分析转染效果 | 第90-92页 |
| ·G418压力筛选阳性细胞 | 第92-93页 |
| ·基因组DNA PCR检测neo基因 | 第93-94页 |
| ·基因组DNA酶切及相应质粒酶切 | 第94页 |
| ·Southern blotting | 第94-95页 |
| ·pMPN和pMIGR1-5’UTR分别与包装质粒共转染HEK293-T细胞结果 | 第95-96页 |
| ·pMPN转染PK-15细胞包装结果 | 第96-97页 |
| 4 讨论 | 第97-100页 |
| ·pMP载体的结构 | 第97-98页 |
| ·pMPN的构建元件IRES | 第98页 |
| ·pMPN的表达及整合能力 | 第98-99页 |
| ·pMPN的转染效率 | 第99页 |
| ·pMP与异源结构蛋白的结合能力 | 第99-100页 |
| ·pMP与不同类型PERV结构蛋白的结合能力 | 第100页 |
| 5 结论 | 第100-102页 |
| 参考文献 | 第102-114页 |
| 致谢 | 第114-116页 |
| 附录 | 第116-121页 |
| 作者简历 | 第121-122页 |
