| 中文摘要 | 第1-9页 |
| 英文摘要 | 第9-12页 |
| 一.前言 | 第12-23页 |
| 二.材料与方法 | 第23-50页 |
| (一) 材料 | 第23-25页 |
| 1.人类基因组BAC文库高密度膜 | 第23页 |
| 2.人类基因组BAC文库 | 第23页 |
| 3.菌株与质粒 | 第23-24页 |
| 4.实验用小鼠 | 第24页 |
| 5.限制性内切酶及修饰酶 | 第24页 |
| 6.其它主要试剂 | 第24-25页 |
| 7.放射性核素 | 第25页 |
| 8.主要仪器设备 | 第25页 |
| (二) 实验方法 | 第25-50页 |
| 1.BAC介导的人β-珠蛋白基因簇转基因鼠的基本技术路线 | 第25-27页 |
| 2.获得含完整人β-珠蛋白基因簇的BAC克隆 | 第27-32页 |
| ·质粒DNA的制备 | 第27-28页 |
| ·聚乙二醇(PEG)法回收DNA片段 | 第28页 |
| ·DNA探针的标记 | 第28-29页 |
| ·人类基因组BAC文库高密度膜的杂交 | 第29-30页 |
| ·从人类基因组BAC文库中挑选阳性克隆 | 第30页 |
| ·BAC DNA的小量制备 | 第30页 |
| ·脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析BAC阳性克隆 | 第30-31页 |
| ·Southern杂交鉴定BAC阳性克隆 | 第31页 |
| ·BAC DNA的大量制备 | 第31页 |
| ·BAC DNA的末端直接测序 | 第31页 |
| ·利用原位荧光杂交(FISH)对BAC DNA进行染色体定位 | 第31-32页 |
| ·BAC DNA的部分限制性内切酶酶切图谱分析 | 第32页 |
| 3.利用同源重组从包含完整人β-珠蛋白基因簇的BAC DNA中定位删除HS3的核心序列 | 第32-37页 |
| ·利用同源重组在E.Coli中对BAC进行修饰的基本技术路线 | 第32-34页 |
| ·用于重组的穿梭载体的构建 | 第34-36页 |
| ·含有BAC DNA的感受态细胞的制备 | 第36页 |
| ·感受态细胞的转化及重组体的正-筛选 | 第36页 |
| ·反筛选(Fusaric Acid)确定突变YAC克隆 | 第36页 |
| ·Southern杂交鉴定BAC突变体 | 第36-37页 |
| 4.显微注射用BAC DNA的制备与纯化 | 第37页 |
| 5.受精卵培养基的配制与保存 | 第37页 |
| 6.小鼠的选择与处理 | 第37-39页 |
| 7.超排卵和取卵 | 第39-41页 |
| 8.显微注射 | 第41-43页 |
| 9.输卵管移卵 | 第43-45页 |
| 10.胚胎小鼠器官组织的采集和保存 | 第45页 |
| 11.鼠尾基因组DNA的提取 | 第45-46页 |
| 12.利用PCR和Southern杂交鉴定转基因鼠 | 第46页 |
| 13.转基因鼠传代 | 第46页 |
| 14.阳性胎鼠的PCR快速鉴定 | 第46-47页 |
| 15.组织RNA提取 | 第47-48页 |
| 16.RNase保护实验检测转基因鼠中人β-珠蛋白转基因的表达 | 第48-49页 |
| 17.毛细管电泳检测转基因鼠中的人β-珠蛋白 | 第49-50页 |
| 三.实验结果 | 第50-74页 |
| (一) 含完整人β-珠蛋白基因簇的BAC克隆的筛选和鉴定 | 第50-58页 |
| 1.人类基因组BAC文库高密度膜的杂交 | 第50页 |
| 2.脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析BAC阳性克隆 | 第50-51页 |
| 3.Southern杂交鉴定BAC阳性克隆 | 第51页 |
| 4.BAC186D7的末端直接测序 | 第51页 |
| 5.利用FISH对BAC186D7进行染色体定位 | 第51-58页 |
| 6.BAC186D7的部分限制性内切酶酶切图谱分析 | 第58页 |
| (二) 利用同源重组从含完整人β-珠蛋白基因簇的BAC DNA中定位删除HS3的核心序列 | 第58-60页 |
| 1.用于重组的穿梭载体pSV-RecA-HS3的构建 | 第58-60页 |
| 2.穿梭载体在BAC186D7大肠杆菌细胞中的同源重组和重组体的正负筛选 | 第60页 |
| 3.Southern杂交鉴定BAC186D7的突变体βHS3M1 | 第60页 |
| (三) 显微注射用BAC DNA的制备与纯化 | 第60-63页 |
| (四) 转基因鼠系的建立 | 第63-74页 |
| 1.正常β-BAC186D7转基因鼠系的建立 | 第63页 |
| 2.正常BAC186D7转基因鼠中人β-珠蛋白基因表达分析 | 第63-66页 |
| 3.转基因鼠中人β-珠蛋白的检测 | 第66-67页 |
| 4.βHS3M1转基因鼠系的建立及其中人β-类珠蛋白基因表达分析 | 第67-74页 |
| 四.讨论 | 第74-79页 |
| (一) 含人类基因组DNA片段的BAC克隆用于转基因动物研究 | 第74-75页 |
| (二) 正常BAC186D7转基因鼠株系的建立 | 第75-77页 |
| (三) HS3的调控功能 | 第77-79页 |
| 五.小结 | 第79-80页 |
| 六.参考文献 | 第80-89页 |
| 七.综述 | 第89-100页 |
| 八.英文名词及缩写 | 第100-102页 |
| 九.致谢 | 第102页 |
