| 摘要 | 第1-3页 |
| Abstract | 第3-7页 |
| 前言 | 第7-8页 |
| 第一章 材料和方法 | 第8-26页 |
| 材料 | 第8-9页 |
| ·质粒、细菌、细胞 | 第8页 |
| ·仪器 | 第8页 |
| ·试剂 | 第8-9页 |
| 方法 | 第9-26页 |
| 1.目的基因的获取 | 第9-15页 |
| ·Ihh及eGFP引物的设计及合成 | 第9-10页 |
| ·PCR扩增Ihh目的基因片段 | 第10-12页 |
| ·PCR扩增体系(25ul)扩增Ihh基因片段 | 第10页 |
| ·PCR大反应扩增体系体系(200ul)扩增Ihh | 第10-11页 |
| ·Ihh目的基因片断的切胶回收 | 第11-12页 |
| ·重叠PCR扩增Ihh-eGFP | 第12-14页 |
| ·PCR扩增体系(25ul)分别扩增Ihh及eGFP | 第12页 |
| ·PCR大反应扩增体系(200ul)分别扩增Ihh及eGFP | 第12-13页 |
| ·Ihh及eGFP目的基因片断的切胶回收 | 第13页 |
| ·重叠PCR扩增Ihh-eGFP的融合基因 | 第13页 |
| ·PCR大反应体系(200ul)扩增Ihh-eGFP的融合基因 | 第13-14页 |
| ·Ihh及Ihh-eGFP的大反应体系PCR反应产物的酶切与纯化 | 第14-15页 |
| ·Ihh及Ihh-eGFP的大反应体系PCR反应产物的酶切 | 第14页 |
| ·Ihh杆GFP DNA酶切体系的纯化回收 | 第14-15页 |
| 2.穿梭质粒pSNAV的获取和鉴定 | 第15-17页 |
| ·大肠杆菌感受态的制备和pSNAV的转化 | 第15-16页 |
| ·碱裂法小量提取质粒pSNAV | 第16页 |
| ·pSNAV的酶切与纯化 | 第16-17页 |
| 3.纯化后质粒pSNAV与Ihh及Ihh-eGFP片段的连接反应 | 第17-19页 |
| ·质粒pSNAV与Ihh的连接: | 第17页 |
| ·质粒pSNAV与Ihh-eGFP片段 | 第17页 |
| ·连接产物pSNAV-Ihh-eGFP的扩增 | 第17-18页 |
| ·菌液PCR鉴定连接 | 第18-19页 |
| ·质粒pSNAV-Ihh及pSNAV-Ihh-eGFP的测序 | 第19页 |
| 4.人胚软骨细胞的分离、培养、鉴定 | 第19-21页 |
| ·人胚软骨细胞的分离 | 第19页 |
| ·人胚软骨细胞的原代培养 | 第19-20页 |
| ·人胚软骨细胞的传代培养 | 第20页 |
| ·人胚软骨细胞的组织化学染色鉴定 | 第20-21页 |
| ·软骨细胞特殊染色鉴定 | 第20页 |
| ·软骨细胞免疫组织化学染色鉴定 | 第20-21页 |
| ·软骨细胞透射电镜观察 | 第21页 |
| 5.pSNAV-Ihh及pSNAV-Ihh-eGFP分别转染人胚软骨细胞的生物学效应 | 第21-26页 |
| ·基因体外表达人胚软骨细胞模型的建立 | 第21页 |
| ·ExGen 500介导pSNAV-Ihh及pSNAV-Ihh-eGFP转染人胚软骨细胞生物学效应 | 第21-26页 |
| ·ExGen 500介导pSNAV-Ihh-eGFP转染条件的优化 | 第21-22页 |
| ·Ihh对细胞增殖生长曲线的研究 | 第22页 |
| ·Ihh对细胞增殖活力的研究(MTT) | 第22-23页 |
| ·细胞内Ihh基因及其受体PTCH的半定量分析 | 第23-26页 |
| ·分别提取转染后软骨细胞中的总RNA | 第23页 |
| ·分别逆转录提取出的总RNA | 第23-24页 |
| ·Ihh及其受体PTCH的RT-PCR反应体系 | 第24-26页 |
| 第二章 结果 | 第26-35页 |
| 6.载体构建结果 | 第26-29页 |
| ·Ihh目的基因PCR扩增结果 | 第26页 |
| ·Ihh及eGFP目的基因PCR扩增结果: | 第26-27页 |
| ·Ihh-eGFP融合基因重叠PCR扩增结果 | 第27-28页 |
| ·pSNAV-Ihh的构建结果 | 第28页 |
| ·pSNAV-Ihh-eGFP的构建结果 | 第28-29页 |
| 7.人胚软骨细胞培养结果 | 第29-31页 |
| ·倒置显微镜观察结果 | 第29-30页 |
| ·甲苯胺蓝染色结果 | 第30页 |
| ·Ⅱ型胶原免疫组织化学染色结果 | 第30-31页 |
| ·培养软骨细胞投射电镜观察结果 | 第31页 |
| 8.目的基因转染后对软骨细胞的生物学效应 | 第31-35页 |
| ·ExGen 500介导pSNAV-Ihh-eGFP转染条件的优化结果 | 第31-32页 |
| ·Ihh对细胞增殖生长曲线的研究 | 第32-33页 |
| ·Ihh对细胞增殖活力的研究(MTT) | 第33页 |
| ·细胞内Ihh基因及其受体PTCH的半定量分析 | 第33-35页 |
| 第三章 讨论 | 第35-42页 |
| 第四章 结论 | 第42-43页 |
| 参考文献 | 第43-46页 |
| 综述 | 第46-55页 |
| 综述参考文献 | 第52-55页 |
| 攻读学位期间的科研成果 | 第55-56页 |
| 附录 | 第56-58页 |
| 致谢 | 第58-60页 |
| 附图 | 第60-63页 |
