| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-7页 |
| 符号与缩略语 | 第11-12页 |
| 第一章 文献综述 | 第12-22页 |
| 1.1 L-氨基酸氧化酶概述 | 第12页 |
| 1.2 α-酮酸的研究与应用 | 第12-14页 |
| 1.2.1 α-酮酸的应用 | 第13页 |
| 1.2.2 α-酮酸合成方法的研究 | 第13-14页 |
| 1.3 LAAO酶活检测方法 | 第14-18页 |
| 1.3.1 O_2消耗量的检测方法 | 第15-16页 |
| 1.3.2 L-氨基酸的检测方法 | 第16页 |
| 1.3.3 氨的检测方法 | 第16页 |
| 1.3.4 α-酮酸的检测方法 | 第16页 |
| 1.3.5 H_2O_2的检测方法 | 第16-17页 |
| 1.3.6 PAGE胶内检测方法 | 第17-18页 |
| 1.3.7 FAD辅因子的检测方法 | 第18页 |
| 1.4 LAAO的异源表达 | 第18-19页 |
| 1.5 结论 | 第19-20页 |
| 1.6 选题意义、技术路线、研究内容及目标 | 第20-22页 |
| 1.6.1 选题意义 | 第20页 |
| 1.6.2 技术路线 | 第20-21页 |
| 1.6.3 研究内容 | 第21-22页 |
| 第二章 LAAO转化合成α-酮酸转化条件的优化研究 | 第22-38页 |
| 2.1 前言 | 第22页 |
| 2.2 材料与方法 | 第22-25页 |
| 2.2.1 菌种来源 | 第22-23页 |
| 2.2.2 主要仪器 | 第23页 |
| 2.2.3 主要药品与试剂 | 第23-24页 |
| 2.2.4 培养基 | 第24页 |
| 2.2.5 培养方法 | 第24页 |
| 2.2.6 转化反应 | 第24页 |
| 2.2.7 底物浓度的选择 | 第24页 |
| 2.2.8 初始反应pH的选择 | 第24页 |
| 2.2.9 反应温度的选择 | 第24-25页 |
| 2.2.10 金属离子的选择 | 第25页 |
| 2.2.11 辅酶FAD浓度的选择 | 第25页 |
| 2.2.12 α-酮异己酸和苯乙酮酸标准曲线的绘制 | 第25页 |
| 2.3 结果与分析 | 第25-37页 |
| 2.3.1 标准曲线的绘制 | 第25-26页 |
| 2.3.2 底物浓度对转化的影响 | 第26-28页 |
| 2.3.3 初始反应pH对转化的影响 | 第28页 |
| 2.3.4 反应温度对转化的影响 | 第28-29页 |
| 2.3.5 金属离子对转化的影响 | 第29-30页 |
| 2.3.6 辅酶FAD对转化的影响 | 第30-31页 |
| 2.3.7 响应面法优化转化反应条件 | 第31-33页 |
| 2.3.8 响应面交互作用分析与优化 | 第33-36页 |
| 2.3.9 验证实验 | 第36-37页 |
| 2.4 本章小结 | 第37-38页 |
| 第三章 普鲁士蓝琼脂平板法检测LAAO活性 | 第38-53页 |
| 3.1 前言 | 第38-39页 |
| 3.2 材料与方法 | 第39-43页 |
| 3.2.1 菌种来源 | 第39页 |
| 3.2.2 主要仪器 | 第39-40页 |
| 3.2.3 主要药品与试剂 | 第40-41页 |
| 3.2.4 培养基 | 第41页 |
| 3.2.5 培养方法 | 第41页 |
| 3.2.6 LAAO的催化反应 | 第41-42页 |
| 3.2.7 普鲁士蓝琼脂平板法 | 第42页 |
| 3.2.8 硫酸铵盐析 | 第42-43页 |
| 3.2.9 SDS-PAGE及LAAO蛋白条带的确定 | 第43页 |
| 3.3 结果与分析 | 第43-52页 |
| 3.3.1 检测液pH值的确定 | 第43-44页 |
| 3.3.2 H_2O_2浓度的定量测定 | 第44-48页 |
| 3.3.3 底物特异性的检测 | 第48-49页 |
| 3.3.4 盐析饱和度的确定 | 第49-50页 |
| 3.3.5 LAAO蛋白条带的确定 | 第50-52页 |
| 3.4 实验小结 | 第52-53页 |
| 第四章 LAAO基因工程菌的构建 | 第53-74页 |
| 4.1 前言 | 第53页 |
| 4.2 材料与方法 | 第53-64页 |
| 4.2.1 菌种与质粒 | 第53-54页 |
| 4.2.2 主要仪器 | 第54页 |
| 4.2.3 主要药品与试剂 | 第54-55页 |
| 4.2.4 培养基 | 第55页 |
| 4.2.5 引物 | 第55-56页 |
| 4.2.6 E.coli BL21 (DE3)/pET28b-lao菌株构建实验流程 | 第56-57页 |
| 4.2.7 E. coli BL21(DE3)/pET20b-lao菌株构建实验流程 | 第57页 |
| 4.2.8 PCR技术扩增LAAO基因 | 第57-61页 |
| 4.2.9 重组质粒pMD-lao、pET28b(+)和pET20b(+)质粒的双酶切 | 第61-62页 |
| 4.2.10 连接与转化 | 第62-63页 |
| 4.2.11 E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-lao和E.coli BL21(DE3)/pET20b(+)-lao菌株构建 | 第63-64页 |
| 4.2.12 重组菌株的SDS-PAGE检测 | 第64页 |
| 4.2.13 酶活力测定 | 第64页 |
| 4.3 实验结果 | 第64-73页 |
| 4.3.1 lao目的基因的获得 | 第64-67页 |
| 4.3.2 重组表达质粒pET28b(+)-lao和pET20b(+)-lao构建 | 第67-69页 |
| 4.3.3 重组质粒pET28b(+)-lao和pET20b(+)-lao鉴定 | 第69-71页 |
| 4.3.4 目的基因在大肠杆菌中的诱导表达 | 第71-72页 |
| 4.3.5 重组菌株E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-lao和E.coli BL21(DE3)/pETb(+)-lao酶活力检测 | 第72-73页 |
| 4.4 实验小结 | 第73-74页 |
| 第五章 总结与展望 | 第74-76页 |
| 5.1 结论 | 第74页 |
| 5.2 展望 | 第74-76页 |
| 参考文献 | 第76-81页 |
| 致谢 | 第81-82页 |
| 攻读硕士学位期间主要科研成果 | 第82页 |
