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Connexin突变导致先天性白内障的遗传学及功能分析

摘要第4-8页
ABSTRACT第8-11页
引言第15-17页
1 实硷试剂、仪器和材料第17-25页
    1.1 实验仪器第17页
    1.2 实验试剂和材料第17-25页
        1.2.1 主要试剂第17-18页
        1.2.2 主要材料第18页
        1.2.3 主要试剂配制第18-25页
2 实验方法第25-41页
    2.1 家系收集第25页
        2.1.1 家系调查与病史询问第25页
        2.1.2 样本采集第25页
        2.1.3 病例诊断第25页
    2.2 外周血基因组DNA抽提第25-26页
    2.3 聚合酶链式反应第26-27页
    2.4 突变检测第27-29页
        2.4.1 候选基因引物的设计第27-29页
        2.4.2 对各候选基因进行PCR扩增及测序第29页
        2.4.3 测序结果分析第29页
    2.5 分子克隆相关实验第29-32页
        2.5.1 超级感受态细胞制备第29-30页
        2.5.2 目的片段合成第30页
        2.5.3 琼脂糖凝胶电泳纯化及回收目的片段第30-31页
        2.5.4 酶切第31页
        2.5.5 T4 DNA ligase酶连第31-32页
        2.5.6 质粒转化第32页
        2.5.7 挑取单克隆提取质粒以及酶切鉴定第32页
    2.6 细胞复苏、培养、传代以及细胞冻存第32-33页
        2.6.1 细胞复苏第32页
        2.6.2 细胞培养、传代第32-33页
        2.6.3 细胞冻存第33页
    2.7 细胞转染第33页
    2.8 RNA提取以及反转录得到CDNA第33-35页
        2.8.1 RNA提取第33-34页
        2.8.2 反转录cDNA第34-35页
    2.9 免疫荧光第35页
    2.10 REAL TIME PCR第35-36页
    2.11 蛋白样品制备与处理第36页
    2.12 DYE UPTAKE ASSAY检测CONNEXIN的半通道功能第36页
    2.13 免疫印迹WESTERN BLOT第36-38页
        2.13.1 配制SDS-PAGE蛋白变性胶第36-37页
        2.13.2 蛋白样处理及上样第37页
        2.13.3 蛋白电泳以及转膜第37-38页
        2.13.4 PVDF膜封闭以及抗体孵育第38页
        2.13.5 发光鉴定第38页
    2.14 MTS法检测细胞增殖速率第38-41页
3 实验结果第41-55页
    3.1 Cx46移码突变(CX46FS400)可能是先天性白内障的诱因第41-45页
        3.1.1 家系一临床诊断与遗传学分析第41-42页
        3.1.2 家系一致病基因的筛选与鉴定第42-43页
        3.1.3 生物信息学分析Cx46突变对其蛋白结构的影响第43页
        3.1.4 生物信息学分析Cx46突变对其蛋白结构的影响第43-44页
        3.1.5 GJA3移码突变导致Cx46在病人晶状体组织中表达量下降第44-45页
    3.2 在一常染色体显性遗传的先天性白内障家系(家系二)中鉴定发现Cx50发生插入突变(Cx50-95 insert)第45-55页
        3.2.1 家系二临床诊断与遗传学分析第45-46页
        3.2.2 家系致病基因筛查与鉴定第46-47页
        3.2.3 Cx50突变位点附近氨基酸序列具有高度保守性第47-48页
        3.2.4 Cx50-95 insert导致Cx50膜定位方式发生改变第48页
        3.2.5 Cx50-95insert突变诱发Cx50半通道功能受损第48-49页
        3.2.6 过表达Cx50-WT和Cx50-95insert诱导HLE发生ER-Stress第49-50页
        3.2.7 Cx50-95insert与溶酶体发生共定位第50-51页
        3.2.8 Cx50-95insert未能明显改变HLE细胞增殖速率第51-52页
        3.2.9 Cx50在小鼠晶状体中表达情况第52-55页
4 讨论第55-57页
结论第57-59页
参考文献第59-61页
综述第61-73页
    参考文献第69-73页
致谢第73-75页
在读期间参加学术活动以及研究成果、奖励第75页

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