| 摘要 | 第3-6页 |
| ABSTRACT | 第6-8页 |
| 前言 | 第13-18页 |
| 第一章 紫杉醇诱导休眠肿瘤干细胞 | 第18-39页 |
| 1.1 实验材料 | 第18-22页 |
| 1.1.1 实验细胞 | 第18页 |
| 1.1.2 主要实验试剂 | 第18-20页 |
| 1.1.3 主要实验器材 | 第20页 |
| 1.1.4 主要试剂配置 | 第20-22页 |
| 1.2 实验方法 | 第22-28页 |
| 1.2.1 紫杉醇处理肿瘤细胞 | 第22-23页 |
| 1.2.2 紫杉醇诱导耐药细胞 | 第23页 |
| 1.2.3 流式细胞术(FCM)检测表面标记CD34和CD133 | 第23页 |
| 1.2.4 Trizol提取总RNA与逆转录 | 第23-24页 |
| 1.2.5 实时定量基因扩增荧光检测(real time-PCR) | 第24-25页 |
| 1.2.6 MTS检测细胞存活率 | 第25-26页 |
| 1.2.7 EdU增殖检测试剂盒检测增殖能力 | 第26页 |
| 1.2.8 RIPA提取细胞总蛋白 | 第26-27页 |
| 1.2.9 Western-blot检测蛋白表达 | 第27-28页 |
| 1.2.10 统计学分析 | 第28页 |
| 1.3 实验结果 | 第28-37页 |
| 1.3.1 紫杉醇诱导肿瘤细胞多药耐药并获得“干性” | 第28-34页 |
| 1.3.2 肿瘤干细胞处于不活跃的休眠期 | 第34-35页 |
| 1.3.3 高浓度紫杉醇诱导耐药细胞进入休眠 | 第35-37页 |
| 1.4 讨论 | 第37-38页 |
| 1.5 小结 | 第38-39页 |
| 第二章 紫杉醇通过降低pHi促进耐药肿瘤细胞休眠 | 第39-45页 |
| 2.1 实验材料 | 第39页 |
| 2.1.1 实验细胞 | 第39页 |
| 2.1.2 主要实验试剂 | 第39页 |
| 2.1.3 主要实验器材 | 第39页 |
| 2.1.4 主要试剂配置 | 第39页 |
| 2.2 实验方法 | 第39-40页 |
| 2.2.1 BCECF,AM测定pH_i | 第39-40页 |
| 2.2.2 pH_i标准曲线绘制 | 第40页 |
| 2.2.3 测定pH_i | 第40页 |
| 2.2.4 Cariporide抑制NHE1活性 | 第40页 |
| 2.3 实验结果 | 第40-43页 |
| 2.3.1 休眠的肿瘤细胞pH_i值成酸性 | 第40-41页 |
| 2.3.2 休眠肿瘤细胞NHE1表达下调 | 第41-42页 |
| 2.3.3 NHE1抑制剂Cariporide降低耐药细胞pH_i,并抑制增殖 | 第42-43页 |
| 2.4 讨论 | 第43-44页 |
| 2.5 小结 | 第44-45页 |
| 第三章 酸性胞内环境通过激活泛素蛋白酶体系统降解MCM7促进耐药细胞休眠 | 第45-56页 |
| 3.1 实验材料 | 第45页 |
| 3.1.1 实验细胞 | 第45页 |
| 3.1.2 主要实验试剂 | 第45页 |
| 3.1.3 主要实验器材 | 第45页 |
| 3.1.4 主要试剂配置 | 第45页 |
| 3.2 实验方法 | 第45-47页 |
| 3.2.1 MG-132抑制蛋白酶体活性 | 第45页 |
| 3.2.2 染色体免疫沉淀(ChIP) | 第45-47页 |
| 3.2.3 免疫共沉淀(CoIP) | 第47页 |
| 3.3 实验结果 | 第47-54页 |
| 3.3.1 酸性胞内环境下,蛋白泛素化水平升高 | 第47-48页 |
| 3.3.2 MG-132抑制蛋白酶体活性,胞内蛋白泛素化水平升高 | 第48-49页 |
| 3.3.3 高浓度紫杉醇诱导MG-132处理的耐药细胞凋亡 | 第49-50页 |
| 3.3.4 酸性胞内环境通过激活泛素蛋白酶体系统降解增殖相关蛋白 | 第50-51页 |
| 3.3.5 紫杉醇通过降解MCM7,抑制E2F1活性 | 第51-53页 |
| 3.3.6 干扰MCM7表达抑制肿瘤休眠再活化 | 第53-54页 |
| 3.4 讨论 | 第54-55页 |
| 3.5 小结 | 第55-56页 |
| 第四章 干扰MCM7通过抑制CDK1活性,促进有丝分裂退出 | 第56-69页 |
| 4.1 实验材料 | 第56页 |
| 4.1.1 实验细胞 | 第56页 |
| 4.1.2 主要实验试剂 | 第56页 |
| 4.1.3 主要实验器材 | 第56页 |
| 4.1.4 主要试剂配置 | 第56页 |
| 4.2 实验方法 | 第56-58页 |
| 4.2.1 胸腺嘧啶核苷(TdR)双阻断法同步化细胞 | 第56-57页 |
| 4.2.2 流式细胞术检测细胞周期 | 第57页 |
| 4.2.3 Chromatin-binding assay分离染色质与非染色质蛋白 | 第57页 |
| 4.2.4 RNA干扰MCM7表达 | 第57-58页 |
| 4.2.5 诺考达唑同步化细胞 | 第58页 |
| 4.2.6 免疫组化检测MCM7表达 | 第58页 |
| 4.2.7 免疫荧光检测MCM7和β-tubulin | 第58页 |
| 4.3 实验结果 | 第58-67页 |
| 4.3.1 MCMs mRNA在不同细胞周期的表达 | 第58-60页 |
| 4.3.2 MCM4,MCM6和MCM7在G2/M期稳定结合在染色质上 | 第60-61页 |
| 4.3.3 MCM7在整个有丝分裂中期都有表达 | 第61-62页 |
| 4.3.4 干扰MCM7表达促进M期退出 | 第62-65页 |
| 4.3.5 干扰MCM7表达导致异常有丝分裂 | 第65-67页 |
| 4.4 讨论 | 第67-68页 |
| 4.5 小结 | 第68-69页 |
| 总结 | 第69-72页 |
| 参考文献 | 第72-78页 |
| 攻读硕士期间成果 | 第78-79页 |
| 致谢 | 第79-80页 |
