| 致谢 | 第5-6页 |
| 摘要 | 第6-7页 |
| Abstract | 第7页 |
| 中英文缩写对照表 | 第13-14页 |
| 第一章 文献综述 | 第14-28页 |
| 1.1 他汀类药物简介 | 第14页 |
| 1.2 阿托伐他汀钙 | 第14-17页 |
| 1.2.1 阿托伐他汀钙简介 | 第14-15页 |
| 1.2.2 阿托伐他汀钙的合成 | 第15-16页 |
| 1.2.3 手性侧链(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯(A7)的合成 | 第16-17页 |
| 1.3 卤醇脱卤酶简介 | 第17-21页 |
| 1.3.1 卤醇脱卤酶的来源与分类 | 第17-19页 |
| 1.3.2 卤醇脱卤酶的结构特点和催化机制 | 第19页 |
| 1.3.3 卤醇脱卤酶的应用 | 第19-20页 |
| 1.3.4 卤醇脱卤酶的基因挖掘 | 第20-21页 |
| 1.4 酶的分子改造 | 第21-26页 |
| 1.4.1 定向进化 | 第21-23页 |
| 1.4.2 理性设计 | 第23-24页 |
| 1.4.3 半理性设计 | 第24-26页 |
| 1.5 本课题的研究思路及研究内容 | 第26-28页 |
| 第二章 卤醇脱卤酶的基因挖掘与克隆表达 | 第28-45页 |
| 2.1 引言 | 第28页 |
| 2.2 实验材料与设备 | 第28-32页 |
| 2.2.1 菌种与质粒 | 第28页 |
| 2.2.2 实验试剂与药品 | 第28-29页 |
| 2.2.3 培养基与试剂配制 | 第29-31页 |
| 2.2.4 实验仪器与设备 | 第31-32页 |
| 2.3 实验方法 | 第32-39页 |
| 2.3.1 菌种的保藏和活化 | 第32页 |
| 2.3.2 基因来源与测序 | 第32-33页 |
| 2.3.3 重组表达质粒的构建 | 第33-34页 |
| 2.3.4 转化 | 第34-35页 |
| 2.3.5 重组菌的验证和诱导表达 | 第35页 |
| 2.3.6 重组菌的收集与细胞破碎 | 第35页 |
| 2.3.7 SDS-PAGE蛋白电泳 | 第35-36页 |
| 2.3.8 酶活测定方法 | 第36-38页 |
| 2.3.9 蛋白浓度测定方法 | 第38-39页 |
| 2.3.10 蛋白质相关参数的计算 | 第39页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第39-44页 |
| 2.4.1 卤醇脱卤酶基因挖掘 | 第39-41页 |
| 2.4.2 重组菌的构建 | 第41-42页 |
| 2.4.3 卤醇脱卤酶的异源表达 | 第42-43页 |
| 2.4.4 重组菌的酶活测定 | 第43-44页 |
| 2.5 本章小结 | 第44-45页 |
| 第三章 HheA_(AM)的定向进化与半理性设计 | 第45-58页 |
| 3.1 引言 | 第45页 |
| 3.2 实验材料与设备 | 第45页 |
| 3.3 实验方法 | 第45-50页 |
| 3.3.1 易错PCR突变文库的构建 | 第45-46页 |
| 3.3.2 定点饱和突变文库的构建 | 第46-47页 |
| 3.3.3 高通量筛选方法 | 第47-49页 |
| 3.3.4 突变子的复筛 | 第49页 |
| 3.3.5 分子模拟 | 第49-50页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第50-57页 |
| 3.4.1 建立突变率稳定的易错PCR突变文库 | 第50-53页 |
| 3.4.2 高通量筛选 | 第53页 |
| 3.4.3 HheA_(AM)的定向进化 | 第53-54页 |
| 3.4.4 基于结构信息的设计与改造 | 第54-55页 |
| 3.4.5 基于蛋白质序列信息的设计与改造 | 第55-57页 |
| 3.5 本章小结 | 第57-58页 |
| 第四章 HheA_(AM)的组合突变 | 第58-74页 |
| 4.1 引言 | 第58页 |
| 4.2 实验材料与设备 | 第58页 |
| 4.3 实验方法 | 第58-62页 |
| 4.3.1 ISM文库的构建 | 第58页 |
| 4.3.2 CASTing文库的构建 | 第58-60页 |
| 4.3.3 蛋白的纯化 | 第60-61页 |
| 4.3.4 酶学性质研究 | 第61-62页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第62-73页 |
| 4.4.1 ISM策略的应用 | 第62-63页 |
| 4.4.2 C ASTing策略的应用 | 第63-68页 |
| 4.4.3 突变体性质分析 | 第68-70页 |
| 4.4.4 Wt-HheA_(AM)与M4-1的酶学性质分析 | 第70-73页 |
| 4.5 本章小结 | 第73-74页 |
| 第五章 结论与展望 | 第74-76页 |
| 5.1 结论 | 第74页 |
| 5.2 展望 | 第74-76页 |
| 参考文献 | 第76-83页 |
| 附录Ⅰ 本论文涉及的氨基酸序列 | 第83-86页 |
| 附录Ⅱ 本论文涉及的基因序列 | 第86-94页 |
| 附录Ⅲ 本论文涉及的引物列表 | 第94-98页 |
| 作者简介 | 第98页 |