| 摘要 | 第1-7页 |
| ABSTRACT | 第7-17页 |
| 第一章 绪论 | 第17-29页 |
| 1 研究目的和意义 | 第17页 |
| 2 国内外研究进展 | 第17-27页 |
| ·脲酶基因簇 | 第18-19页 |
| ·脲酶动力学性质 | 第19-20页 |
| ·脲酶活性中心 | 第20-21页 |
| ·脲酶依赖于镍的活化 | 第21-22页 |
| ·脲酶催化机制 | 第22页 |
| ·脲酶抑制剂种类 | 第22-24页 |
| ·瘤胃壁和瘤胃液中产脲酶菌种类 | 第24-25页 |
| ·元基因组学应用于瘤胃微生物研究 | 第25-26页 |
| ·利用免疫方法调控瘤胃微生物代谢 | 第26-27页 |
| 3 研究内容和技术路线 | 第27-29页 |
| ·研究内容 | 第27-28页 |
| ·技术路线 | 第28-29页 |
| 第二章 瘤胃产脲酶菌及其脲酶基因的分离与鉴定 | 第29-39页 |
| 1 材料与方法 | 第29-33页 |
| ·培养基配制 | 第29-30页 |
| ·接种与富集 | 第30页 |
| ·脲酶基因 qPCR 相对定量 | 第30-32页 |
| ·平板分离单菌落 | 第32页 |
| ·PCR 鉴定细菌 16S rDNA | 第32页 |
| ·PCR 鉴定脲酶基因 | 第32-33页 |
| ·测序和分析 | 第33页 |
| ·细菌形态特征和脲酶活性 | 第33页 |
| 2 结果与分析 | 第33-37页 |
| ·产脲酶菌的富集 | 第33-34页 |
| ·产脲酶菌及其脲酶基因的鉴定 | 第34-35页 |
| ·脲酶基因的系统发育分析 | 第35-36页 |
| ·产脲酶菌脲酶活力 | 第36-37页 |
| ·产脲酶菌形态特征 | 第37页 |
| 3 讨论 | 第37-38页 |
| 4 本章结论 | 第38-39页 |
| 第三章 基于元基因组学的瘤胃脲酶基因多样性分析 | 第39-62页 |
| 1 材料与方法 | 第39-41页 |
| ·脲酶基因 ARB 数据库构建 | 第39页 |
| ·脲酶基因引物扩增覆盖性 | 第39页 |
| ·瘤胃内容物与瘤胃壁微生物 DNA 提取 | 第39-40页 |
| ·脲酶基因 PCR 产物制备 | 第40-41页 |
| ·PCR 产物 454 测序 | 第41页 |
| ·脲酶基因多样性分析 | 第41页 |
| ·脲酶基因 qPCR 相对定量 | 第41页 |
| 2 结果与分析 | 第41-59页 |
| ·脲酶基因在细菌种类中的分布 | 第41-42页 |
| ·脲酶基因拷贝数 | 第42-43页 |
| ·脲酶基因引物 PCR 扩增覆盖性 | 第43页 |
| ·脲酶基因 OTU 阈值 | 第43-44页 |
| ·脲酶基因 PCR 产物制备 | 第44-45页 |
| ·脲酶基因 454 序列信息 | 第45-47页 |
| ·脲酶基因主成分分析 | 第47页 |
| ·脲酶基因稀疏度曲线 | 第47-48页 |
| ·脲酶基因α多样性 | 第48-49页 |
| ·脲酶基因β多样性 | 第49-50页 |
| ·脲酶基因丰度聚类分析 | 第50-53页 |
| ·脲酶基因 OTU 网络 | 第53-54页 |
| ·脲酶基因丰度比较 | 第54-56页 |
| ·脲酶基因 OTU 的细菌来源 | 第56-59页 |
| ·脲酶基因 qPCR 相对定量 | 第59页 |
| 3 讨论 | 第59-61页 |
| 4 本章结论 | 第61-62页 |
| 第四章 幽门螺杆菌脲酶蛋白的表达与多克隆抗体的制备 | 第62-69页 |
| 1 材料与方法 | 第62-64页 |
| ·脲酶基因的克隆 | 第62页 |
| ·脲酶蛋白的小量表达 | 第62-63页 |
| ·脲酶蛋白的大量表达 | 第63页 |
| ·镍金属螯合层析纯化 | 第63页 |
| ·抗脲酶多克隆抗体的制备 | 第63-64页 |
| 2 结果与分析 | 第64-67页 |
| ·脲酶基因的克隆 | 第64页 |
| ·脲酶蛋白的小量表达 | 第64-65页 |
| ·脲酶蛋白的大量表达 | 第65页 |
| ·脲酶蛋白的纯化 | 第65-66页 |
| ·抗脲酶多克隆抗体的制备 | 第66-67页 |
| 3 讨论 | 第67-68页 |
| 4 本章结论 | 第68-69页 |
| 第五章 幽门螺杆菌脲酶与瘤胃脲酶的免疫交叉反应性质分析 | 第69-75页 |
| 1 材料与方法 | 第69-71页 |
| ·瘤胃内容物的采集 | 第69页 |
| ·菌体蛋白的提取 | 第69页 |
| ·脲酶的纯化 | 第69-70页 |
| ·脲酶活性的测定 | 第70页 |
| ·脲酶的活性电泳与染色 | 第70页 |
| ·LC-MS/MS 鉴定 | 第70页 |
| ·Western-blotting检测 | 第70-71页 |
| 2 结果与分析 | 第71-73页 |
| ·瘤胃脲酶的纯化 | 第71-72页 |
| ·脲酶活性电泳和染色 | 第72页 |
| ·脲酶的质谱鉴定 | 第72-73页 |
| ·两种脲酶的免疫交叉反应 | 第73页 |
| 3 讨论 | 第73-74页 |
| 4 本章结论 | 第74-75页 |
| 第六章 抗脲酶多克隆抗体对尿素分解和产脲酶菌的影响 | 第75-82页 |
| 1 材料与方法 | 第75-77页 |
| ·抗脲酶多克隆抗体血清 | 第75页 |
| ·McDougall 缓冲液 | 第75页 |
| ·试验处理 | 第75页 |
| ·瘤胃液的接种 | 第75-76页 |
| ·样品采集与检测 | 第76页 |
| ·DGGE 分析 | 第76页 |
| ·脲酶基因相对定量 | 第76页 |
| ·统计与分析 | 第76-77页 |
| 2 结果与分析 | 第77-80页 |
| ·抗脲酶多克隆抗体对瘤胃发酵的影响 | 第77页 |
| ·抗脲酶多克隆抗体对尿素分解的影响 | 第77-78页 |
| ·抗脲酶多克隆抗体对细菌群落的影响 | 第78-79页 |
| ·抗脲酶多克隆抗体对产脲酶菌比例的影响 | 第79-80页 |
| 3 讨论 | 第80-81页 |
| 4 本章结论 | 第81-82页 |
| 第七章 奶牛免疫幽门螺杆菌脲酶对瘤胃尿素分解的影响 | 第82-89页 |
| 1 材料与方法 | 第82-83页 |
| ·试验设计 | 第82-83页 |
| ·样品采集 | 第83页 |
| ·样品检测 | 第83页 |
| ·统计与分析 | 第83页 |
| 2 结果与分析 | 第83-87页 |
| ·奶牛免疫后血清中特异性抗体效价变化 | 第83-84页 |
| ·奶牛免疫后唾液中特异性抗体效价变化 | 第84-85页 |
| ·奶牛免疫后瘤胃发酵变化 | 第85页 |
| ·奶牛免疫后瘤胃脲酶活力变化 | 第85-86页 |
| ·瘤胃灌注尿素后氨氮浓度变化 | 第86-87页 |
| ·奶牛免疫后瘤胃动态降解率变化 | 第87页 |
| 3 讨论 | 第87-88页 |
| 4 本章结论 | 第88-89页 |
| 第八章 总体结论 | 第89-91页 |
| 1 论文总体结论 | 第89-90页 |
| 2 本研究创新点 | 第90页 |
| 3 有待进一步研究的问题 | 第90-91页 |
| 参考文献 | 第91-99页 |
| 附录 | 第99-120页 |
| 附录一 厌氧培养基配制方法 | 第99-102页 |
| 附录二 瘤胃液微生物总 DNA 提取和纯化 | 第102-103页 |
| 附录三 DNA 测序 | 第103-104页 |
| 附录四 细菌脲酶活性的测定 | 第104-105页 |
| 附录五 精料日粮条件下脲酶基因 OTU 表 | 第105-109页 |
| 附录六 粗料日粮条件下脲酶基因 OTU 表 | 第109-115页 |
| 附录七 间接 ELISA 测定特异性抗体效价 | 第115-116页 |
| 附录八 瘤胃液中氨氮的检测（靛酚蓝法） | 第116-117页 |
| 附录九 瘤胃液中挥发性脂肪酸(VFA)的测定 | 第117-118页 |
| 附录十 变性梯度凝胶电泳（DGGE） | 第118-120页 |
| 致谢 | 第120-121页 |
| 个人简历 | 第121-123页 |
