| 摘要 | 第1-7页 |
| ABSTRACT | 第7-19页 |
| 第一章 绪论 | 第19-29页 |
| ·甘油途径 | 第19-21页 |
| ·甘油的生理学意义 | 第19页 |
| ·酵母渗透压应答机制及甘油合成途径 | 第19-20页 |
| ·甘油作为重要的平台化合物 | 第20-21页 |
| ·生物鲁棒性 | 第21页 |
| ·3-羟基丙酸概况 | 第21-25页 |
| ·3-羟基丙酸理化性质与用途 | 第21-22页 |
| ·3-羟基丙酸的生产方法 | 第22-23页 |
| ·利用微生物发酵生产3-羟基丙酸 | 第23-24页 |
| ·生产菌种 | 第24-25页 |
| ·3-羟基丙酸代谢途径的辅酶平衡 | 第25-26页 |
| ·本课题的立项意义 | 第26-29页 |
| 第二章 产甘油重组大肠杆菌构建及耐高渗透压性能测定 | 第29-47页 |
| ·引言 | 第29-30页 |
| ·实验材料 | 第30页 |
| ·菌株与质粒 | 第30页 |
| ·试剂与仪器 | 第30页 |
| ·培养基 | 第30页 |
| ·实验方法 | 第30-38页 |
| ·酿酒酵母S. cerevisiae基因组DNA的提取 | 第30-31页 |
| ·培养条件 | 第31页 |
| ·聚合酶链式反应(PCR)扩增目的基因GPD1和GPP2 | 第31-33页 |
| ·载体模块pET-GPD1和pET-GPP2的构建 | 第33页 |
| ·质粒pET-GPD1和pET-GPP2的鉴定 | 第33-34页 |
| ·表达载体pET-G12的构建 | 第34页 |
| ·序列测定与分析 | 第34页 |
| ·重组质粒pET-G12化学转化法转化E.coli.BL-21 | 第34-35页 |
| ·重组质粒pET-G12在E.coli BL-21中的表达 | 第35-37页 |
| ·甘油途径对重组大肠杆菌耐高渗胁迫能力的影响 | 第37-38页 |
| ·发酵参数分析 | 第38页 |
| ·结果与讨论 | 第38-45页 |
| ·S. cerevisiae基因组DNA的提取 | 第38-39页 |
| ·聚合酶链式反应扩增基因GPD1和GPP2 | 第39-40页 |
| ·载体模块pET-GPD1和pET-GPP2的构建 | 第40-41页 |
| ·表达载体pET-G12的构建 | 第41-42页 |
| ·GPD1-GPP2基因的序列测定与分析 | 第42页 |
| ·重组菌E.coli BG12中3-磷酸甘油脱氢酶及3-磷酸甘油酯酶的表达 | 第42-43页 |
| ·重组菌产甘油发酵 | 第43页 |
| ·大肠杆菌高渗溶液耐受浓度 | 第43-44页 |
| ·甘油的途径的表达对重组菌渗透压耐受能力的影响 | 第44-45页 |
| ·本章小结 | 第45-47页 |
| 第三章 甘油途径在肺炎克雷伯杆菌中的表达研究 | 第47-59页 |
| ·引言 | 第47-48页 |
| ·实验材料 | 第48-49页 |
| ·菌株、质粒 | 第48页 |
| ·试剂与仪器 | 第48-49页 |
| ·培养基 | 第49页 |
| ·实验方法 | 第49-52页 |
| ·K. pneumoniae基因组的提取 | 第49页 |
| ·K. pneumoniae组成型启动了的扩增 | 第49-51页 |
| ·Pk启动子与质粒pET-28a的连接、转化 | 第51页 |
| ·表达载体pKP-G12的构建 | 第51-52页 |
| ·K. pneumoniae感受态细胞的制备及电转化 | 第52页 |
| ·重组菌KG12在表达K. pneumoniae中的表达 | 第52页 |
| ·实验结果 | 第52-57页 |
| ·K. pneumoniae基因组的提取 | 第52-53页 |
| ·K. pneumoniae组成型启动子Pk的扩增 | 第53-54页 |
| ·质粒pET-28a的提取 | 第54页 |
| ·阳性克隆鉴定 | 第54-55页 |
| ·质粒pET-kp提取 | 第55页 |
| ·PG12为模板扩增G12表达盒 | 第55-56页 |
| ·阳性克隆鉴定 | 第56页 |
| ·3-磷酸甘油脱氢酶及3-磷酸甘油酯酶的在K. pneumoniae中表达 | 第56-57页 |
| ·本章小结 | 第57-59页 |
| 第四章 在K.pneumoniae中构建辅酶平衡系统 | 第59-71页 |
| ·引言 | 第59-60页 |
| ·实验材料 | 第60-61页 |
| ·菌株、质粒 | 第60页 |
| ·试剂与仪器 | 第60页 |
| ·培养基 | 第60-61页 |
| ·实验方法 | 第61-66页 |
| ·表达盒Pk-ald4-dhaB的扩增 | 第61-62页 |
| ·GPD1,GPP2, ald4与dhaB基因串联共表达质粒的构建 | 第62-63页 |
| ·重组质粒pKGAB电击法转化K. pneumoniae | 第63-64页 |
| ·3-磷酸甘油脱氢酶GPD1,3-磷酸甘油酯酶GPP2,醛脱氢酶基因ald4与甘油脱水酶基因dhaB在K. pneumoniae中的表达 | 第64页 |
| ·重组菌的发酵培养 | 第64页 |
| ·高效液相色谱(HPLC)检测代谢产物的浓度 | 第64-66页 |
| ·结果与讨论 | 第66-69页 |
| ·质粒pKP-AB的提取与表达盒kp-ald4-dhaB的扩增 | 第66-67页 |
| ·转化产物的鉴定 | 第67-68页 |
| ·重组菌的表达 | 第68-69页 |
| ·本章小结 | 第69-71页 |
| 第五章 重组菌产3-羟基丙酸研究及NAD再生系统引入对生产的影响 | 第71-83页 |
| ·引言 | 第71页 |
| ·实验材料 | 第71-72页 |
| ·菌株、质粒 | 第71页 |
| ·试剂与仪器 | 第71页 |
| ·培养基 | 第71-72页 |
| ·实验方法 | 第72-73页 |
| ·重组菌的发酵培养 | 第72页 |
| ·生物量的测定 | 第72页 |
| ·产物的检测 | 第72-73页 |
| ·底物的检测 | 第73页 |
| ·结果与讨论 | 第73-81页 |
| ·引入NAD对于重组菌发酵参数的影响 | 第73-76页 |
| ·发酵参数 | 第76-77页 |
| ·有机酸的产量 | 第77页 |
| ·添加葡萄糖对发酵产3-hp的影响 | 第77-81页 |
| ·本章小结 | 第81-83页 |
| 第六章 实验总结与建议 | 第83-85页 |
| ·主要结论 | 第83-84页 |
| ·本论文的创新点 | 第84页 |
| ·问题与建议 | 第84-85页 |
| 参考文献 | 第85-89页 |
| 附录1 试剂 | 第89-91页 |
| 附录2 仪器设备 | 第91-92页 |
| 致谢 | 第92-93页 |
| 研究成果及发表的学术论文 | 第93-94页 |
| 作者和导师简介 | 第94页 |
