| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 第一章 绪论 | 第12-24页 |
| 1.1 2-酮基葡萄糖酸激酶（KguK）概述 | 第12-13页 |
| 1.1.1 KguK的来源 | 第12页 |
| 1.1.2 KguK同源蛋白的结构与功能 | 第12-13页 |
| 1.2 细菌中 2KGA的合成与代谢 | 第13-16页 |
| 1.2.1 细菌的 2KGA合成 | 第13-15页 |
| 1.2.2 细菌的 2KGA代谢 | 第15-16页 |
| 1.3 重组蛋白的表达 | 第16-21页 |
| 1.3.1 大肠杆菌表达系统 | 第16-19页 |
| 1.3.2 毕赤酵母表达系统 | 第19-21页 |
| 1.4 立题背景与意义 | 第21-22页 |
| 1.5 主要研究内容 | 第22-24页 |
| 第二章 变形假单胞菌 2-酮基葡萄糖酸激酶基因的克隆表达与生物信息学分析 | 第24-51页 |
| 2.1 实验材料 | 第24-29页 |
| 2.1.1 菌株与质粒 | 第24-25页 |
| 2.1.2 主要生化试剂与配制 | 第25-28页 |
| 2.1.3 主要仪器与设备 | 第28-29页 |
| 2.2 实验方法 | 第29-38页 |
| 2.2.1 变形假单胞菌JUIM01基因组的提取 | 第29页 |
| 2.2.2 PCR引物设计与合成 | 第29页 |
| 2.2.3 kguK基因片段的扩增与PCR产物的回收 | 第29-30页 |
| 2.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第30页 |
| 2.2.5 kguK基因的克隆与测序 | 第30-31页 |
| 2.2.6 KguK蛋白序列的分析 | 第31页 |
| 2.2.7 kguK基因原核表达载体的构建与鉴定 | 第31-32页 |
| 2.2.8 重组表达菌株的构建与重组蛋白的诱导表达 | 第32-33页 |
| 2.2.9 蛋白表达分析与鉴定 | 第33-34页 |
| 2.2.10 重组KguK蛋白的纯化 | 第34-35页 |
| 2.2.11 蛋白浓度的测定 | 第35页 |
| 2.2.12 KguK的酶活测定 | 第35-37页 |
| 2.2.13 重组KguK蛋白亲和层析法复性 | 第37-38页 |
| 2.3 实验结果与分析 | 第38-50页 |
| 2.3.1 变形假单胞菌kguK基因的克隆 | 第38-39页 |
| 2.3.2 变形假单胞菌KguK蛋白生物信息学分析 | 第39-41页 |
| 2.3.3 原核表达载体的构建与鉴定 | 第41-44页 |
| 2.3.4 重组KguK蛋白的诱导表达 | 第44-49页 |
| 2.3.5 重组KguK蛋白的复性 | 第49-50页 |
| 2.4 本章小结 | 第50-51页 |
| 第三章 变形假单胞菌 2-酮基葡萄糖酸激酶基因在毕赤酵母中的表达 | 第51-69页 |
| 3.1 实验材料 | 第51-52页 |
| 3.1.1 菌株与质粒 | 第51页 |
| 3.1.2 主要试剂与工具酶 | 第51-52页 |
| 3.1.3 培养基 | 第52页 |
| 3.1.4 缓冲溶液配制 | 第52页 |
| 3.1.5 仪器与设备 | 第52页 |
| 3.2 实验方法 | 第52-59页 |
| 3.2.1 变形假单胞菌kguK基因的优化与合成 | 第52-53页 |
| 3.2.2 毕赤酵母重组表达载体的构建 | 第53-56页 |
| 3.2.3 重组毕赤酵母菌株的构建 | 第56-58页 |
| 3.2.4 重组KguK蛋白在重组毕赤酵母中的诱导表达 | 第58页 |
| 3.2.5 重组KguK蛋白的SDS-PAGE分析与Western-Blot鉴定 | 第58-59页 |
| 3.2.6 重组KguK蛋白的纯化与酶活测定 | 第59页 |
| 3.3 实验结果与分析 | 第59-68页 |
| 3.3.1 kguK基因密码子的优化 | 第59-60页 |
| 3.3.2 重组表达载体的构建 | 第60-62页 |
| 3.3.3 重组毕赤酵母菌株的构建 | 第62-64页 |
| 3.3.4 重组KguK蛋白表达与鉴定 | 第64-65页 |
| 3.3.5 重组KguK蛋白的纯化 | 第65-66页 |
| 3.3.6 重组KguK的酶活测定结果 | 第66-68页 |
| 3.4 本章小结 | 第68-69页 |
| 第四章 变形假单胞菌2-酮基葡萄糖酸激酶基因的敲除及其对2KGA发酵特性的影响 | 第69-84页 |
| 4.1 实验材料 | 第69-70页 |
| 4.1.1 菌株和质粒 | 第69页 |
| 4.1.2 培养基 | 第69-70页 |
| 4.1.3 主要实验试剂 | 第70页 |
| 4.1.4 主要仪器与设备 | 第70页 |
| 4.2 实验方法 | 第70-77页 |
| 4.2.1 PCR引物设计与合成 | 第70-71页 |
| 4.2.2 kugK基因缺失片段的克隆 | 第71-72页 |
| 4.2.3 重组自杀质粒的构建 | 第72-73页 |
| 4.2.4 变形假单胞菌JUIM01电转感受态制备 | 第73-74页 |
| 4.2.5 变形假单胞菌JUIM01的电转化 | 第74页 |
| 4.2.6 变形假单胞菌kguK基因缺失突变株的筛选与鉴定 | 第74-76页 |
| 4.2.7 菌株JUIM01与JUIM01ΔkguK的 2KGA发酵特性比较 | 第76-77页 |
| 4.3 实验结果与分析 | 第77-83页 |
| 4.3.1 变形假单胞菌kguK基因缺失片段的扩增 | 第77-78页 |
| 4.3.2 重组敲除质粒pK18mobsacB-ΔkguK的构建 | 第78页 |
| 4.3.3 变形假单胞菌kguK基因敲除菌株的筛选与鉴定 | 第78-79页 |
| 4.3.4 变形假单胞菌kguK敲除菌株与原始菌株的 2KGA发酵特性比较 | 第79-83页 |
| 4.4 本章小结 | 第83-84页 |
| 第五章 结论与展望 | 第84-87页 |
| 5.1 主要结论 | 第84-85页 |
| 5.2 存在问题与展望 | 第85-87页 |
| 参考文献 | 第87-98页 |
| 致谢 | 第98-99页 |
| 硕士期间发表的论文 | 第99页 |
