| 致谢 | 第10-11页 |
| 摘要 | 第11-13页 |
| ABSTRACT | 第13-14页 |
| 1 绪论 | 第15-33页 |
| 1.1 引言 | 第15-16页 |
| 1.2 里氏木霉纤维素酶体系 | 第16-18页 |
| 1.3 其它来源的纤维素酶 | 第18-20页 |
| 1.4 外源蛋白在里氏木霉中的表达 | 第20-25页 |
| 1.4.1 里氏木霉的基因工程策略 | 第21页 |
| 1.4.2 里氏木霉的转化策略 | 第21-23页 |
| 1.4.3 里氏木霉的基因定向整合 | 第23-24页 |
| 1.4.4 定向整合的RNA工具 | 第24页 |
| 1.4.5 里氏木霉基因工程综合策略 | 第24-25页 |
| 1.5 里氏木霉的基因表达调控 | 第25-28页 |
| 1.5.1 纤维素酶的诱导物 | 第25-26页 |
| 1.5.2 里氏木霉对不溶性底物的识别 | 第26页 |
| 1.5.3 纤维素酶启动子的结构 | 第26-27页 |
| 1.5.4 纤维素酶的转录调控 | 第27-28页 |
| 1.5.5 调节纤维素酶表达的信号途径 | 第28页 |
| 1.6 里氏木霉胞外蛋白的分泌途径 | 第28-31页 |
| 1.6.1 通往内质网的途径 | 第29页 |
| 1.6.2 内质网中的蛋白成熟 | 第29-30页 |
| 1.6.3 内质网质量控制 | 第30-31页 |
| 1.6.4 后内质网途径 | 第31页 |
| 1.6.5 蛋白质糖基化 | 第31页 |
| 1.7 CBH2基因工程研究进展 | 第31-33页 |
| 2 里氏木霉CBH2基因的克隆与在大肠杆菌中的表达 | 第33-45页 |
| 2.1 引言 | 第33页 |
| 2.2 材料与方法 | 第33-39页 |
| 2.2.1 质粒与菌株 | 第33-34页 |
| 2.2.2 工具酶与试剂 | 第34页 |
| 2.2.3 培养基 | 第34-35页 |
| 2.2.4 实验仪器 | 第35页 |
| 2.2.5 里氏木霉cbh2基因的克隆与重组质粒的构建 | 第35-37页 |
| 2.2.5.1 里氏木霉总RNA的提取 | 第35页 |
| 2.2.5.2 反转录PCR制备里氏木霉cbh2基因 | 第35-36页 |
| 2.2.5.3 重组质粒pET28a(+)-cbh2的构建 | 第36-37页 |
| 2.2.6 大肠杆菌的转化 | 第37-38页 |
| 2.2.6.1 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第37页 |
| 2.2.6.2 大肠杆菌转化与转化子筛选 | 第37页 |
| 2.2.6.3 重组质粒的PCR验证 | 第37页 |
| 2.2.6.4 重组质粒的扩增、提取与纯化 | 第37-38页 |
| 2.2.7 里氏木霉cbh2基因在大肠杆菌中的表达 | 第38页 |
| 2.2.7.1 重组大肠杆菌的构建 | 第38页 |
| 2.2.7.2 里氏木霉cbh2基因的诱导表达 | 第38页 |
| 2.2.7.3 胞内蛋白提取 | 第38页 |
| 2.2.8 测定方法 | 第38-39页 |
| 2.2.8.1 纤维二糖水解酶活力的测定 | 第38-39页 |
| 2.2.8.2 蛋白质电泳 | 第39页 |
| 2.2.8.3 菌体浓度的测定 | 第39页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第39-43页 |
| 2.3.1 反转录PCR获得里氏木霉cbh2基因 | 第39-40页 |
| 2.3.2 克隆载体的酶切验证 | 第40页 |
| 2.3.3 表达载体的PCR验证 | 第40-41页 |
| 2.3.4 里氏木霉cbh2基因序列分析 | 第41-42页 |
| 2.3.5 里氏木霉cbh2在大肠杆菌中的诱导表达 | 第42-43页 |
| 2.4 小结 | 第43-45页 |
| 3 里氏木霉CBH2基因在毕赤酵母中的表达 | 第45-63页 |
| 3.1 上言 | 第45页 |
| 3.2 材料与方法 | 第45-51页 |
| 3.2.1 质粒与菌株 | 第45页 |
| 3.2.2 工具酶与试剂 | 第45-46页 |
| 3.2.3 培养基 | 第46页 |
| 3.2.4 实验仪器 | 第46页 |
| 3.2.5 毕赤酵母表达载体的构建 | 第46-47页 |
| 3.2.6 大肠杆菌的转化 | 第47页 |
| 3.2.7 里氏木霉cbh2基因在毕赤酵母中的表达 | 第47-50页 |
| 3.2.7.1 重组毕赤酵母的构建 | 第47-48页 |
| 3.2.7.2 重组毕赤酵母的筛选 | 第48页 |
| 3.2.7.3 重组毕赤酵母基因组DNA的提取 | 第48-49页 |
| 3.2.7.4 重组毕赤酵母的PCR鉴定 | 第49-50页 |
| 3.2.7.5 里氏木霉cbh2基因的诱导表达 | 第50页 |
| 3.2.8 测定方法 | 第50-51页 |
| 3.2.8.1 纤维二糖水解酶活力的测定 | 第50页 |
| 3.2.8.2 蛋白质电泳 | 第50页 |
| 3.2.8.3 菌体浓度测定 | 第50页 |
| 3.2.8.4 可溶性蛋白的测定 | 第50-51页 |
| 3.2.9 统计学分析 | 第51页 |
| 3.2.10 CBHⅡ蛋白结构的预测与模拟 | 第51页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第51-61页 |
| 3.3.1 毕赤酵母表达载体的构建与PCR验证 | 第51-55页 |
| 3.3.2 重组毕赤酵母的诱导与发酵 | 第55-57页 |
| 3.3.3 重组蛋白的SDS-PAGE | 第57-58页 |
| 3.3.4 重组CBHⅡ的酶学性质研究 | 第58-59页 |
| 3.3.5 CBHⅡ蛋白结构的预测与模拟 | 第59-61页 |
| 3.4 小结 | 第61-63页 |
| 4 里氏木霉转化方法与转化子筛选方法的建立与优化 | 第63-79页 |
| 4.1 引言 | 第63页 |
| 4.2 材料与方法 | 第63-69页 |
| 4.2.1 质粒与菌株 | 第63页 |
| 4.2.2 工具酶与试剂 | 第63-64页 |
| 4.2.3 培养基 | 第64-65页 |
| 4.2.4 实验仪器 | 第65页 |
| 4.2.5 重组质粒pCAMBIA1300-hph-PsCT的构建 | 第65页 |
| 4.2.6 大肠杆菌的转化 | 第65页 |
| 4.2.7 根瘤农杆菌介导的里氏木霉转化 | 第65-67页 |
| 4.2.7.1 根瘤农杆菌AGL-1的转化 | 第65-66页 |
| 4.2.7.2 根瘤农杆菌转化子质粒的提取 | 第66-67页 |
| 4.2.7.3 重组根瘤农杆菌的双酶切或PCR鉴定 | 第67页 |
| 4.2.7.4 根瘤农杆菌介导的转化 | 第67页 |
| 4.2.8 里氏木霉转化子的筛选与鉴定 | 第67-68页 |
| 4.2.8.1 里氏木霉转化子的复筛 | 第67-68页 |
| 4.2.8.2 重组里氏木霉基因组的提取 | 第68页 |
| 4.2.8.3 里氏木霉转化子的PCR鉴定 | 第68页 |
| 4.2.9 产酶实验 | 第68页 |
| 4.2.10 测定方法 | 第68-69页 |
| 4.2.10.1 外切葡聚糖酶活力的测定 | 第68页 |
| 4.2.10.2 菌体浓度测定 | 第68-69页 |
| 4.2.10.3 菌体直径测定 | 第69页 |
| 4.2.10.4 滤纸酶活的测定 | 第69页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第69-77页 |
| 4.3.1 重组质粒pCAMBIA1300-hph-PsCT的构建 | 第69页 |
| 4.3.2 农杆菌介导转化过程的优化 | 第69-73页 |
| 4.3.2.1 共培养pH对根瘤农杆菌介导的里氏木霉转化的影响 | 第69-70页 |
| 4.3.2.2 共培养温度对根瘤农杆菌介导的里氏木霉转化的影响 | 第70页 |
| 4.3.2.3 乙酰丁香酮对根瘤农杆菌介导的里氏木霉转化的影响 | 第70-71页 |
| 4.3.2.4 根瘤农杆菌浓度对根瘤农杆菌介导的里氏木霉转化的影响 | 第71-72页 |
| 4.3.2.5 孢子预萌发时间对根瘤农杆菌介导的里氏木霉转化的影响 | 第72-73页 |
| 4.3.3 农杆菌转化子所含质粒的酶切验证 | 第73页 |
| 4.3.4 里氏木霉转化子的遗传稳定性检验及PCR验证 | 第73-74页 |
| 4.3.5 里氏木霉筛选方法的建立 | 第74-76页 |
| 4.3.6 里氏木霉转化子生长速率与酶活的关系 | 第76-77页 |
| 4.4 小结 | 第77-79页 |
| 5 里氏木霉转化子的产酶研究 | 第79-87页 |
| 5.1 引言 | 第79页 |
| 5.2 材料与方法 | 第79-81页 |
| 5.2.1 菌株 | 第79页 |
| 5.2.2 试剂 | 第79-80页 |
| 5.2.3 实验仪器 | 第80页 |
| 5.2.4 培养基 | 第80页 |
| 5.2.5 产酶实验 | 第80页 |
| 5.2.6 测定方法 | 第80-81页 |
| 5.2.6.1 纤维二糖水解酶活力的测定 | 第80页 |
| 5.2.6.2 滤纸酶活力的测定 | 第80页 |
| 5.2.6.3 内切葡聚糖活力的测定 | 第80页 |
| 5.2.6.4 纤维二糖酶活力 | 第80-81页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第81-85页 |
| 5.3.1 纤维二糖水解酶活力对比 | 第81-82页 |
| 5.3.2 滤纸酶活力对比 | 第82-83页 |
| 5.3.3 内切葡聚糖酶活力对比 | 第83页 |
| 5.3.4 纤维二糖酶活力对比 | 第83-85页 |
| 5.4 小结 | 第85-87页 |
| 6 里氏木霉纤维素酶降解木质纤维素的研究 | 第87-99页 |
| 6.1 引言 | 第87页 |
| 6.2 材料与方法 | 第87-90页 |
| 6.2.1 菌株 | 第87-88页 |
| 6.2.2 酶制剂 | 第88页 |
| 6.2.3 实验仪器 | 第88页 |
| 6.2.4 培养基 | 第88页 |
| 6.2.5 产酶实验 | 第88页 |
| 6.2.6 木质纤维素降解 | 第88页 |
| 6.2.7 分析方法 | 第88-90页 |
| 6.2.7.1 纤维二糖水解酶活力的测定 | 第88-89页 |
| 6.2.7.2 滤纸酶活力的测定 | 第89页 |
| 6.2.7.3 内切葡聚糖活力的测定 | 第89页 |
| 6.2.7.4 纤维二糖酶活力测定 | 第89页 |
| 6.2.7.5 木聚糖酶活力测定 | 第89页 |
| 6.2.7.6 糖分测定 | 第89-90页 |
| 6.3 结果与讨论 | 第90-97页 |
| 6.3.1 酶用量对碱处理玉米秸秆和稻草的影响 | 第90-91页 |
| 6.3.2 添加纤维二糖酶的碱处理玉米秸秆和稻草酶水解 | 第91-94页 |
| 6.3.3 添加纤维二糖酶和木聚糖酶的碱处理玉米秸秆和稻草酶水解 | 第94-96页 |
| 6.3.4 不同来源纤维素酶酶解得率的比较 | 第96-97页 |
| 6.4 小结 | 第97-99页 |
| 7 结论与展望 | 第99-103页 |
| 7.1 结论 | 第99-101页 |
| 7.2 展望 | 第101-102页 |
| 7.3 论文的创新点 | 第102-103页 |
| 参考文献 | 第103-122页 |
| 作者简历 | 第122页 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 | 第122页 |
