| 中文摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 符号说明 | 第10-11页 |
| 文献综述 | 第11-22页 |
| 一、猪源产肠毒素大肠杆菌HPI研究进展 | 第11-15页 |
| 1. 耶尔森菌强毒力岛(HPI)的研究 | 第11-13页 |
| 1.1 HPI的特征及分类 | 第11-12页 |
| 1.2 HPI的结构和功能 | 第12-13页 |
| 2. 大肠杆菌中HPI的研究 | 第13-14页 |
| 3. K88+ETEC中HPI的发现 | 第14-15页 |
| 二、CRISPR-Cas9基因编辑技术研究进展 | 第15-17页 |
| 1. CRISPR的基因座结构 | 第15页 |
| 2. CRISPR的分布和分类 | 第15-16页 |
| 3. CRISPR/Cas的作用机制 | 第16-17页 |
| 参考文献 | 第17-22页 |
| 研究一 K88ac+产肠毒素大肠杆菌HPI的敲除 | 第22-41页 |
| 1. 材料 | 第22-24页 |
| 1.1 菌株和质粒 | 第22-23页 |
| 1.2 培养基和主要试剂 | 第23页 |
| 1.3 主要仪器 | 第23-24页 |
| 2. 方法 | 第24-33页 |
| 2.1 PCR引物的设计 | 第24页 |
| 2.2 反向PCR构建pTarget-sgRNA1和pTarget-sgRNA2 | 第24-26页 |
| 2.3 感受态细胞的制备及构建质粒的转化 | 第26页 |
| 2.3.1 感受态细胞的制备 | 第26页 |
| 2.3.2 pTargetF-sgRNAl和pTargetF-sgRNA2质粒的转化 | 第26页 |
| 2.4 重组质粒pTargetT的构建 | 第26-30页 |
| 2.5 pCas质粒的转化及鉴定 | 第30-31页 |
| 2.5.1 感受态细胞的制备 | 第30-31页 |
| 2.5.2 电转化 | 第31页 |
| 2.6 重组质粒pTargetT的转化 | 第31页 |
| 2.7 重组质粒pTargeT和质粒pCas的消除 | 第31-32页 |
| 2.7.1 重组质粒pTargetT的消除 | 第31页 |
| 2.7.2 pCas质粒的消除 | 第31-32页 |
| 2.8 HPI缺失株的PCR鉴定 | 第32-33页 |
| 2.8.1 PCR鉴定引物的设计 | 第32页 |
| 2.8.2 缺失株的PCR鉴定 | 第32-33页 |
| 3. 结果 | 第33-38页 |
| 3.1 质粒pTargetF-sgRNA1、 pTargetF-sgRNA2的构建 | 第33-34页 |
| 3.1.1 线性化质粒pTargetF-sgRNA1、pTargetF-sgRNA2的PCR扩增 | 第33-34页 |
| 3.1.2 质粒pTargetF-sgRNA1、pTargetF-sgRNA2的重组 | 第34页 |
| 3.2 质粒pTargetF-sgRNA1-sgRNA2的构建 | 第34-36页 |
| 3.3 重组质粒pTargetT的构建 | 第36-37页 |
| 3.3.1 线性化载体及上下游同源臂的PCR扩增 | 第36页 |
| 3.3.2 质粒pTargetT的构建 | 第36-37页 |
| 3.4 C83902△HPI缺失株的鉴定 | 第37-38页 |
| 4. 讨论 | 第38-40页 |
| 参考文献 | 第40-41页 |
| 研究二 K88ac+产肠毒素大肠杆菌强毒力岛HPI相关功能探析 | 第41-57页 |
| 1. 材料 | 第42-43页 |
| 1.1 菌株与质粒 | 第42页 |
| 1.2 主要试剂 | 第42页 |
| 1.3 主要仪器 | 第42-43页 |
| 2. 方法 | 第43-48页 |
| 2.1 生长试验 | 第43页 |
| 2.2 生物被膜定量试验 | 第43页 |
| 2.3 铁载体检测试验 | 第43-44页 |
| 2.3.1 CAS平板固体检测 | 第43-44页 |
| 2.3.2 CAS液体检测 | 第44页 |
| 2.4 qRT-PCR检测HPI对C83902其它毒力因子的影响 | 第44-48页 |
| 2.4.1 待测基因的引物设计 | 第44-45页 |
| 2.4.2 提取细菌总RNA | 第45-46页 |
| 2.4.3 去除基因组DNA和反转录cDNA第一链 | 第46-47页 |
| 2.4.4 qRT-PCR | 第47页 |
| 2.4.5 数据的分析和处理 | 第47-48页 |
| 2.5 细胞粘附试验 | 第48页 |
| 2.5.1 细胞培养和技术 | 第48页 |
| 2.5.2 细胞黏附试验 | 第48页 |
| 3. 结果 | 第48-53页 |
| 3.1 生长试验 | 第48-49页 |
| 3.2 生物被膜定量试验 | 第49-50页 |
| 3.3 铁载体检测试验 | 第50-51页 |
| 3.3.1 CAS固体平板检测 | 第50页 |
| 3.3.2 CAS液体检测 | 第50-51页 |
| 3.4 qRT-PCR | 第51-52页 |
| 3.5 细胞粘附试验 | 第52-53页 |
| 4. 讨论 | 第53-55页 |
| 参考文献 | 第55-57页 |
| 全文总结 | 第57-58页 |
| 致谢 | 第58-59页 |
| 攻读硕士期间发表的学术论文 | 第59-60页 |
