| 摘要 | 第4-7页 |
| SUMMARY | 第7-10页 |
| 缩略语 | 第11-23页 |
| 文献综述 | 第23-43页 |
| 第一章 哺乳动物胚胎附植前发育过程中的细胞凋亡程序 | 第23-30页 |
| 1. 前言 | 第23页 |
| 2. 细胞凋亡和移植前胚胎发育 | 第23-24页 |
| 3. 胚胎正常发育过程中凋亡的发生 | 第24-28页 |
| 3.1 卵裂时期和致密化胚胎 | 第25页 |
| 3.2 囊胚时期的胚胎 | 第25-28页 |
| 3.2.1 形态学的改变 | 第25-26页 |
| 3.2.2 特定的DNA损伤 | 第26-27页 |
| 3.2.3 可变性 | 第27-28页 |
| 4. 胚胎囊胚期的细胞凋亡程序 | 第28-29页 |
| 5. 总结 | 第29-30页 |
| 第二章 附植前胚胎体外发育过程中生长因子的重要性 | 第30-43页 |
| 1. 生殖系统中生长因子的表达 | 第30-33页 |
| 2. 移植前胚胎表达的生长因子受体 | 第33-34页 |
| 3. 生长因子缺乏的影响 | 第34-38页 |
| 3.1 移植前发育 | 第35-36页 |
| 3.2 胎儿的发育 | 第36页 |
| 3.3 产期及幼年期 | 第36-37页 |
| 3.4 成年的发育 | 第37页 |
| 3.5 基因组印迹 | 第37-38页 |
| 4. 不受控制的生长因子作用 | 第38-39页 |
| 4.1 胚胎共培养优点 | 第38-39页 |
| 4.2 胚胎共培养缺点 | 第39页 |
| 5. 可控制的体外生长因子作用 | 第39-41页 |
| 5.1 动物研究 | 第39-41页 |
| 5.2 人的研究 | 第41页 |
| 6. 总结 | 第41-43页 |
| 实验研究 | 第43-124页 |
| 第三章 EGF通过调控细胞凋亡信号提高牦牛卵母细胞和胚胎发育 | 第43-62页 |
| 第一节 EGF、EGFR在牦牛卵母细胞中表达及对胚胎发育能力作用 | 第43-53页 |
| 1. 材料与方法 | 第44-47页 |
| 1.1 材料和试剂 | 第44页 |
| 1.2 牦牛卵巢的采集及体外成熟培养 | 第44-45页 |
| 1.3 卵母细胞成熟率统计 | 第45页 |
| 1.4 体外受精及卵母细胞分裂率统计 | 第45页 |
| 1.5 RNA提取及cDNA合成 | 第45页 |
| 1.6 Real-time PCR检测EGF、EGFR、Bax、Baxi的表达 | 第45-46页 |
| 1.7 免疫细胞荧光染色检测EGF及EGFR的表达 | 第46页 |
| 1.8 数据分析 | 第46-47页 |
| 2. 结果 | 第47-50页 |
| 2.1 EGF、EGFR基因在牦牛卵母细胞成熟过程中的表达情况 | 第47-48页 |
| 2.2 EGF、EGFR蛋白在牦牛卵母细胞成熟过程中的分布 | 第48页 |
| 2.3 EGF对牦牛卵母细胞成熟率的影响 | 第48-49页 |
| 2.4 EGF对牦牛卵母细胞卵裂率的影响 | 第49页 |
| 2.5 EGF调控牦牛卵母细胞Bax和Baxi基因表达 | 第49-50页 |
| 3. 讨论 | 第50-52页 |
| 4. 结论 | 第52-53页 |
| 第二节 EGF通过调控Survivin和HSP70提高牦牛移植前胚胎的发育能力 | 第53-62页 |
| 1. 材料和方法 | 第53-56页 |
| 1.1 主要材料和试剂 | 第53页 |
| 1.2 牦牛卵巢的采集及体外成熟培养 | 第53页 |
| 1.3 体外受精 | 第53-54页 |
| 1.4 体外培养和实验设计 | 第54页 |
| 1.5 基因表达分析 | 第54-55页 |
| 1.5.1 引物设计 | 第54-55页 |
| 1.5.2 RNA提取和cDNA合成 | 第55页 |
| 1.5.3 Real-time PCR检测EGF、EGFR、HSP70和Survivin表达 | 第55页 |
| 1.6 免疫荧光染色检测胚胎EGF、EGFR蛋白表达 | 第55页 |
| 1.7 囊胚标记和细胞计数 | 第55-56页 |
| 1.8 数据分析 | 第56页 |
| 2. 结果 | 第56-60页 |
| 2.1 EGF、EGFR基因在牦牛胚胎发育中的表达 | 第56-57页 |
| 2.2 EGF、EGFR蛋白在牦牛胚胎发育中的表达 | 第57页 |
| 2.3 EGF对牦牛胚胎发育的影响 | 第57-58页 |
| 2.4 EGF对牦牛囊胚质量的影响 | 第58页 |
| 2.5 EGF对牦牛囊胚HSP70和Survivin的表达的调控 | 第58-60页 |
| 3. 讨论 | 第60-61页 |
| 4. 结论 | 第61-62页 |
| 第四章 IGF-1 通过调控细胞凋亡信号提高牦牛体细胞和胚胎发育 | 第62-80页 |
| 第一节 IGF-1 对牦牛卵丘细胞HSP70表达的影响及其与细胞凋亡的关联性分析 | 第62-72页 |
| 1. 材料和方法 | 第63-66页 |
| 1.1 主要试剂 | 第63页 |
| 1.2 牦牛卵丘细胞的分离及培养 | 第63页 |
| 1.3 IGF-1 作用卵丘细胞 | 第63-64页 |
| 1.4 总RNA的提取及反转录(RT-PCR) | 第64页 |
| 1.5 Real-time PCR检测HSP70、Bax、Bcl-2 的表达 | 第64页 |
| 1.6 免疫细胞荧光染色检测HSP70的表达 | 第64-65页 |
| 1.7 HSP70蛋白表达检测 | 第65页 |
| 1.8 流式细胞技术分析细胞凋亡率 | 第65页 |
| 1.9 数据分析 | 第65-66页 |
| 2. 结果 | 第66-69页 |
| 2.1 IGF-1 对牦牛卵丘细胞HSP70 mRNA的调节 | 第66页 |
| 2.2 IGF-1 对牦牛卵丘细胞HSP70蛋白的调节 | 第66-67页 |
| 2.3 HSP70蛋白在牦牛卵丘细胞分布检测 | 第67-68页 |
| 2.4 IGF-1 对牦牛卵丘细胞Bax、Bcl-2 mRNA的调节 | 第68页 |
| 2.5 IGF-1 对牦牛卵丘细胞凋亡的抑制作用 | 第68-69页 |
| 3 讨论 | 第69-71页 |
| 4 结论 | 第71-72页 |
| 第二节 IGF-1 及其受体在牦牛附植前胚胎中的表达及作用 | 第72-80页 |
| 1. 材料与方法 | 第72-74页 |
| 1.1 材料和试剂 | 第72页 |
| 1.2 牦牛卵巢的采集及体外成熟培养 | 第72-73页 |
| 1.3 体外受精 | 第73页 |
| 1.4 体外培养 | 第73页 |
| 1.5 RNA提取及cDNA合成 | 第73页 |
| 1.6 Real-time PCR检测IGF-1、IGF-1R的表达 | 第73页 |
| 1.7 IGF-1、IGF-1R蛋白表达检测 | 第73-74页 |
| 1.8 免疫荧光染色检测卵母细胞和胚胎IGF-1、IGF-1R蛋白表达 | 第74页 |
| 1.9 实验设计和数据分析 | 第74页 |
| 2. 结果 | 第74-78页 |
| 2.1 IGF-1、IGF-1R mRNA在牦牛卵母细胞和胚胎发育中的表达 | 第74-75页 |
| 2.2 IGF-1、IGF-1R蛋白在牦牛卵母细胞和胚胎发育中的表达 | 第75-76页 |
| 2.3 IGF-1 对牦牛卵母细胞移植前胚胎发育的影响 | 第76-78页 |
| 3. 讨论 | 第78-79页 |
| 4. 结论 | 第79-80页 |
| 第五章 生长因子对牦牛精子生成和活性的调控作用研究 | 第80-97页 |
| 第一节 EGF、EGFR在牦牛睾丸发育过程中的表达 | 第80-88页 |
| 1. 材料与方法 | 第81-82页 |
| 1.1 睾丸组织的采集和处理 | 第81页 |
| 1.2 RNA提取和cDNA合成 | 第81页 |
| 1.3 Real-time PCR检测EGF和EGFR的表达 | 第81页 |
| 1.4 Western blot分析睾丸组织中EGF和EGFR的表达 | 第81-82页 |
| 1.5 免疫组织化学方法检测EGF和EGFR | 第82页 |
| 1.6 数据分析 | 第82页 |
| 2. 结果 | 第82-84页 |
| 2.1 不同年龄睾丸组织中EGF和EGFR mRNA的表达 | 第82-83页 |
| 2.2 不同年龄睾丸组织中EGF和EGFR蛋白的表达 | 第83页 |
| 2.3 EGF在不同年龄睾丸组织的定位 | 第83-84页 |
| 2.4 EGFR在不同年龄睾丸组织的定位 | 第84页 |
| 3. 讨论 | 第84-87页 |
| 4. 结论 | 第87-88页 |
| 第二节 IGF-1 通过调控Bax和Bcl-2 提高牦牛冻精活性和IVF胚胎发育 | 第88-97页 |
| 1. 材料与方法 | 第88-90页 |
| 1.1 冻精分离 | 第88-89页 |
| 1.2 精子活性检测 | 第89页 |
| 1.3 IGF-1 对牦牛卵母细胞卵裂率影响 | 第89页 |
| 1.3.1 卵母细胞收集和体外成熟培养 | 第89页 |
| 1.3.2 体外受精和卵母细胞卵裂率统计 | 第89页 |
| 1.4 牦牛精子中Bax和Bcl-2 基因表达的检测 | 第89-90页 |
| 1.4.1 引物设计 | 第89页 |
| 1.4.2 RNA提取及cDNA合成 | 第89-90页 |
| 1.4.3 Real-time PCR检测Bax、Bcl-2 的表达 | 第90页 |
| 1.5 牦牛精子中Bax和Bcl-2 蛋白表达WB检测 | 第90页 |
| 1.6 细胞免疫荧光染色检测牦牛精子Bax和Bcl-2 蛋白 | 第90页 |
| 1.7 数据分析 | 第90页 |
| 2. 结果 | 第90-94页 |
| 2.1 精子活性 | 第90-91页 |
| 2.2 IGF-1 对卵母细胞卵裂率的作用 | 第91页 |
| 2.3 牦牛精子中Bax和Bcl-2 基因的表达 | 第91-92页 |
| 2.4 牦牛精子中Bax和Bcl-2 蛋白的表达 | 第92-93页 |
| 2.5 牦牛精子中Bax和Bcl-2 蛋白免疫荧光检测 | 第93-94页 |
| 3. 讨论 | 第94-96页 |
| 4. 结论 | 第96-97页 |
| 第六章 重组人BMP-6 提高牦牛卵母细胞及后续克隆胚胎的发育能力 | 第97-107页 |
| 1. 材料与方法 | 第98-100页 |
| 1.1 材料和试剂 | 第98页 |
| 1.2 卵母细胞的收集和体外成熟培养 | 第98页 |
| 1.3 SCNT和胚胎培养 | 第98页 |
| 1.4 IVF和胚胎培养 | 第98-99页 |
| 1.5 免疫荧光检测 | 第99页 |
| 1.6 荧光信号强度分析 | 第99页 |
| 1.7 胚胎中Bax和Bcl-2 基因表达检测 | 第99页 |
| 1.8 数据分析 | 第99-100页 |
| 2. 结果 | 第100-105页 |
| 2.1 BMP6对牦牛克隆胚胎后续发育潜能的作用 | 第100-102页 |
| 2.2 BMP6对牦牛克隆胚胎相关表观遗传蛋白表达的影响 | 第102-104页 |
| 2.3 BMP6对牦牛克隆胚胎囊胚细胞凋亡的影响 | 第104-105页 |
| 3. 讨论 | 第105-106页 |
| 4. 结论 | 第106-107页 |
| 第七章 生长因子提高牦牛卵母细胞冷冻适应性机制研究 | 第107-124页 |
| 第一节 牦牛未成熟卵母细胞Cryotop和SSV玻璃化冷冻保存比较及与HSP90关联性 | 第107-116页 |
| 1. 材料与方法 | 第108-110页 |
| 1.1 材料和试剂 | 第108页 |
| 1.2 卵母细胞的收集和筛选 | 第108页 |
| 1.3 卵母细胞的冷冻和解冻 | 第108页 |
| 1.4 卵母细胞形态的评估 | 第108页 |
| 1.5 卵母细胞体外成熟培养 | 第108-109页 |
| 1.6 卵母细胞体外受精 | 第109页 |
| 1.7 胚胎体外培养 | 第109页 |
| 1.8 RNA提取及cDNA合成 | 第109页 |
| 1.9 Real-time PCR检测HSP90的表达 | 第109页 |
| 1.10 蛋白提取和WB检测HSP90的表达 | 第109页 |
| 1.11 实验设计 | 第109-110页 |
| 1.12 数据分析 | 第110页 |
| 2. 结果 | 第110-113页 |
| 2.1 不同处理组卵母细胞成熟率 | 第110页 |
| 2.2 不同处理组的牦牛胚胎发育 | 第110-112页 |
| 2.3 HSP90 mRNA的表达水平 | 第112页 |
| 2.4 HSP90蛋白的表达水平 | 第112-113页 |
| 3. 讨论 | 第113-115页 |
| 4. 结论 | 第115-116页 |
| 第二节 IGF-1 通过调节CIRP提高冷冻-解冻牦牛成熟卵母细胞发育能力 | 第116-124页 |
| 1. 材料与方法 | 第116-119页 |
| 1.1 材料和试剂 | 第116页 |
| 1.2 成熟卵母细胞的准备 | 第116-117页 |
| 1.3 Real-time PCR检测成熟卵母细胞中CIRPmRNA表达水平 | 第117页 |
| 1.4 WB检测成熟卵母细胞中CIRP蛋白表达水平 | 第117-118页 |
| 1.5 成熟卵母细胞的冷冻与解冻 | 第118页 |
| 1.6 恢复培养 | 第118页 |
| 1.7 牦牛卵母细胞的孤雌激活 | 第118页 |
| 1.8 实验设计 | 第118-119页 |
| 1.9 数据分析 | 第119页 |
| 2. 结果 | 第119-122页 |
| 2.1 不同处理组CIRP mRNA的表达水平 | 第119页 |
| 2.2 不同处理组CIRP蛋白的表达水平 | 第119-120页 |
| 2.3 冷冻解冻后孤雌激活胚胎的发育能力 | 第120-122页 |
| 3. 讨论 | 第122-123页 |
| 4. 结论 | 第123-124页 |
| 全文总结 | 第124-125页 |
| 参考文献 | 第125-148页 |
| 致谢 | 第148-149页 |
| 作者简介 | 第149-151页 |
| 导师简介 | 第151-153页 |
