| 摘要 | 第1-5页 |
| ABSTRACT | 第5-9页 |
| 第一章 前言 | 第9-15页 |
| 1.氧化固醇 | 第9-10页 |
| 2.氧化固醇结合蛋白家族(Oxysterol Binding Proteins,ORPs) | 第10-11页 |
| 3.ORP7 | 第11-12页 |
| 4.GATE-16与GS28 | 第12-13页 |
| 5.本课题的研究内容及假设 | 第13-15页 |
| 第二章 实验材料与仪器 | 第15-23页 |
| 1.主要仪器 | 第15-16页 |
| 2.实验材料 | 第16-17页 |
| ·菌种、细胞与质粒 | 第16页 |
| ·主要试剂 | 第16-17页 |
| 3 试剂配制 | 第17-23页 |
| ·基因克隆主要试剂的配制 | 第17-18页 |
| ·质粒大量抽提试剂 | 第18-19页 |
| ·DNA凝胶电泳试剂 | 第19-20页 |
| ·酵母双杂交实验试剂 | 第20页 |
| ·SDS-PAGE电泳试剂 | 第20-21页 |
| ·Western Blotting实验试剂 | 第21页 |
| ·细胞培养试剂 | 第21-23页 |
| 第三章 实验方法 | 第23-39页 |
| 1.质粒载体的构建 | 第23-28页 |
| ·pGBKT7-ORP7诱饵质粒的构建 | 第23-25页 |
| ·pGBDKT7-ORP7、DGADT7-Gate16片段载体的构建 | 第25页 |
| ·双分子荧光互补实验载体的构建 | 第25-26页 |
| ·shRNA载体的构建 | 第26-28页 |
| 2.感觉态细胞的制备 | 第28页 |
| 3.大肠杆菌DH5 α的转化 | 第28-29页 |
| 4.质粒大量提取 | 第29-31页 |
| 5.酵母双杂交筛选Universal Human cDNA Library | 第31-34页 |
| ·质粒pGBDKT7-ORP7转化酵母菌AH109 | 第31-32页 |
| ·酵母双杂交筛选Universal Human cDNA Library | 第32页 |
| ·β-半乳糖苷酶活性检测 | 第32-33页 |
| ·酵母质粒抽提 | 第33页 |
| ·酵母质粒电击转化大肠杆菌DH5 α | 第33-34页 |
| 6.细胞培养和转染 | 第34页 |
| 7.Western Blotting | 第34-36页 |
| ·蛋白样品的制备 | 第34-35页 |
| ·SDS-PAGE电泳 | 第35页 |
| ·转膜(半干转) | 第35页 |
| ·加一抗孵育 | 第35页 |
| ·加二抗孵育 | 第35-36页 |
| ·化学发光 | 第36页 |
| 8.荧光定量PCR | 第36-38页 |
| ·RNA抽提:(12孔板为例) | 第36页 |
| ·逆转录 | 第36-37页 |
| ·定量PCR | 第37-38页 |
| 9.免疫荧光 | 第38-39页 |
| 第四章 实验结果与分析 | 第39-59页 |
| 1.质粒载体的构建 | 第39-40页 |
| ·诱饵质粒pGBKT7-ORP7的构建 | 第39页 |
| ·ORP7和Gate16的片段克隆 | 第39-40页 |
| 2.酵母双杂交筛选与ORP7相互作用蛋白质 | 第40-42页 |
| ·诱饵蛋白对AH109无毒性、无自激活 | 第41页 |
| ·用pGBKT7-ORP7筛选与ORP7相互作用的蛋白质 | 第41-42页 |
| 3 双分子荧光互补实(BiFC)验验证ORP7与GATE-16的相互作用 | 第42-44页 |
| 4 ORP7、Gate16和GS28的亚细胞定位 | 第44-45页 |
| 5 ORP7与Gate16相互作用的关键结构域 | 第45-48页 |
| 6 ORP7过表达降低GS28蛋白水平 | 第48-50页 |
| 7 ORP7与Gate16相互作用引起GS28通过蛋白酶体途径降解 | 第50-51页 |
| 8 ORP7过表达影响反面高尔基体的结构 | 第51-55页 |
| 9 ORP7介导氧化固醇诱导的GS28蛋白降解 | 第55-59页 |
| 第五章 讨论 | 第59-61页 |
| 全文小结 | 第61-62页 |
| 参考文献 | 第62-69页 |
| 附录一.缩略词中英文对照 | 第69-70页 |
| 附录二.在校期间(待)发表论文 | 第70-71页 |
| 致谢 | 第71页 |
