| 第一部分 miR-548k基因座拷贝数扩增促进食管鳞癌恶性增殖及淋巴结转移的机制研究 | 第10-85页 |
| 缩略词语表 | 第11-14页 |
| 中文摘要 | 第14-16页 |
| Abstract | 第16-18页 |
| 前言 | 第18-21页 |
| 材料与方法 | 第21-55页 |
| 1. 实验材料 | 第21-33页 |
| 1.1 菌种、质粒和细胞株 | 第21-22页 |
| 1.2 实验动物 | 第22-23页 |
| 1.3 主要试剂 | 第23-25页 |
| 1.4 引物的合成与设计 | 第25-27页 |
| 1.5 Hsa-miR-548k mimic和inhibitor | 第27页 |
| 1.6 主要仪器设备 | 第27-28页 |
| 1.7 生物学软件 | 第28页 |
| 1.8 常用试剂的配制 | 第28-33页 |
| 2. 实验方法 | 第33-55页 |
| 2.1 对细胞的处理 | 第33-34页 |
| 2.2 MiR-548k慢病毒载体构建和包装(本部分由吉凯基因完成) | 第34-35页 |
| 2.3 稳定高表达miR-548k细胞系的筛选 | 第35-37页 |
| 2.4 细胞增殖实验 | 第37页 |
| 2.5 细胞克隆形成实验 | 第37页 |
| 2.6 细胞周期检测 | 第37页 |
| 2.7 细胞侵袭转移实验(xCELLigence Real-Time Cell Analyzer) | 第37页 |
| 2.8 细胞侵袭迁移实验(Transwell assay) | 第37-39页 |
| 2.9 细胞总RNA和总蛋白的提取 | 第39-40页 |
| 2.10 蛋白和RNA浓度测定 | 第40-41页 |
| 2.11 逆转录(Reverse Transcription,RT)与PCR扩增 | 第41页 |
| 2.12 Western Blot | 第41-44页 |
| 2.13 感受态细胞的制备 | 第44-45页 |
| 2.14 细菌的转化 | 第45页 |
| 2.15 质粒提取及鉴定 | 第45-47页 |
| 2.16 免疫共沉淀(Immunoprecipitation,IP)试验 | 第47页 |
| 2.17 免疫荧光(Immunofluoresence,IF) | 第47-48页 |
| 2.18 裸鼠移植瘤实验 | 第48页 |
| 2.19 裸鼠肺转移模型 | 第48-49页 |
| 2.20 裸鼠上肢膝后窝淋巴结转移模型(Popliteal lymph node metastasis model) | 第49页 |
| 2.21 裸鼠食管原位成瘤模型 | 第49-50页 |
| 2.22 条件培养基的浓缩与分析 | 第50页 |
| 2.23 内皮细胞成管试验 | 第50-51页 |
| 2.24 内皮细胞迁移实验 | 第51页 |
| 2.25 免疫组织化学 | 第51-52页 |
| 2.26 microRNA原位杂交(in situ hybridization histochemistry；ISH) | 第52-54页 |
| 2.27 靶基因3’UTR与miRNA结合实验(双荧光素酶报告系统实验) | 第54页 |
| 2.28 统计分析 | 第54-55页 |
| 实验结果 | 第55-75页 |
| 1. MIR-548K定位于高频率拷贝数扩增区域11Q13.3-11Q13.4 | 第55-56页 |
| 2. MIR-548K在食管鳞癌中存在过表达并且与生存预后和淋巴结转移相关 | 第56-58页 |
| 3. MIR-548K增强食管鳞癌细胞的增殖和克隆形成能力 | 第58-61页 |
| 4. MIR-548K加快食管鳞癌细胞的G_2/M期转换 | 第61-62页 |
| 5. MIR-548K促进食管鳞癌细胞发生侵袭转移 | 第62-63页 |
| 6. MIR-548K促进食管鳞癌细胞裸鼠皮下成瘤和食管原位成瘤 | 第63-64页 |
| 7. MIR-548K增强食管鳞癌细胞移植瘤的浸润能力和血行肺转移能力 | 第64-65页 |
| 8. MIR-548K通过下调细胞周期G_2期检测点激酶WEE1而加快G_2/M期进展,促进细胞增殖 | 第65-68页 |
| 9. MIR-548K通过抑制转录因子KLF10的表达而增强EGFR通路活性,促进细胞增殖和侵袭转移 | 第68-70页 |
| 10. MIR-548K能够趋化淋巴内皮细胞,促进淋巴管形成 | 第70-72页 |
| 11. MIR-548K抑制ADAMTS1的表达而促进淋巴管形成 | 第72-75页 |
| 讨论 | 第75-79页 |
| 1. MIR-548K可作为食管鳞癌生存预后和淋巴结转移的分子标志物 | 第75-76页 |
| 2. MIR-548K通过靶基因WEE1参与细胞周期调控 | 第76-77页 |
| 3. MIR-548K靶向KLF10而上调EGFR的表达,并增强其下游通路的活性 | 第77页 |
| 4. MIR-548K下调ADAMTS1的表达而促进食管鳞癌细胞发生淋巴结转移 | 第77-78页 |
| 5. 展望：MIR-548K有望成为临床诊治的新靶标 | 第78-79页 |
| 结论 | 第79-80页 |
| 参考文献 | 第80-85页 |
| 第二部分 PCLO在食管鳞癌发生发展中的作用及其分子机制研究 | 第85-159页 |
| 缩略词语表 | 第86-88页 |
| 中文摘要 | 第88-90页 |
| Abstract | 第90-92页 |
| 前言 | 第92-95页 |
| 材料与方法 | 第95-128页 |
| 1. 实验材料 | 第95-106页 |
| 1.0 菌种、质粒和细胞株 | 第95-96页 |
| 1.1 实验动物 | 第96页 |
| 1.2 主要试剂 | 第96-97页 |
| 1.3 主要试剂盒 | 第97-98页 |
| 1.4 其他试剂 | 第98-99页 |
| 1.5 引物的合成与设计 | 第99-100页 |
| 1.6 小干扰RNA(siRNA)的合成 | 第100页 |
| 1.7 主要仪器设备 | 第100-101页 |
| 1.8 生物学软件 | 第101页 |
| 1.9 常用试剂的配制 | 第101-106页 |
| 2. 实验方法 | 第106-128页 |
| 2.1 对细胞的处理 | 第106页 |
| 2.2 EGF处理细胞 | 第106页 |
| 2.3 细胞瞬时转染 | 第106-107页 |
| 2.4 RNAi慢病毒载体构建和包装(本部分由上海吉凯基因化学技术有限公司完成) | 第107-109页 |
| 2.5 稳定敲降PCLO细胞系的筛选 | 第109-110页 |
| 2.6 细胞增殖实验 | 第110页 |
| 2.7 细胞克隆形成实验 | 第110页 |
| 2.8 细胞周期检测 | 第110页 |
| 2.9 细胞侵袭转移实验(xCELLigence Real-Time Cell Analyzer) | 第110-111页 |
| 2.10 细胞侵袭转移实验(Transwell assay) | 第111-112页 |
| 2.11 总蛋白的提取和细胞总RNA | 第112-113页 |
| 2.12 胞核-胞浆-胞膜蛋白制备 | 第113-115页 |
| 2.13 蛋白和RNA浓度测定 | 第115-116页 |
| 2.14 逆转录(Reverse Transcription,RT)与PCR扩增 | 第116-117页 |
| 2.15 Western Blot | 第117-119页 |
| 2.16 感受态细胞的制备 | 第119-120页 |
| 2.17 细菌的转化 | 第120页 |
| 2.18 质粒提取及鉴定 | 第120-122页 |
| 2.19 免疫共沉淀(Immunoprecipitation,IP)试验 | 第122页 |
| 2.20 免疫荧光(Immunofluoresence,IF) | 第122-123页 |
| 2.21 裸鼠移植瘤实验 | 第123页 |
| 2.22 裸鼠肺转移模型 | 第123-124页 |
| 2.23 免疫组织化学 | 第124-125页 |
| 2.24 Piccolo小鼠单克隆抗体制备 | 第125页 |
| 2.25 单抗效价检测 | 第125-126页 |
| 2.26 单克隆抗体内毒素含量测定 | 第126-127页 |
| 2.27 单克隆抗体亚型测定 | 第127页 |
| 2.28 统计分析 | 第127-128页 |
| 实验结果 | 第128-151页 |
| 1. PCLO基因在食管鳞癌(ESCC)中存在高频率突变和较高的拷贝数扩增 | 第128-130页 |
| 2. PCLO基因在其它癌症中存在高频率突变和较多的拷贝数扩增 | 第130-131页 |
| 3. PCLO在ESCC和其它多种肿瘤中都存在MRNA水平上调情况 | 第131-132页 |
| 4. PICCOLO的过表达与ESCC的生存预后差率显著相关 | 第132-135页 |
| 5. PICCOLO是一个潜在的早期(T1期)ESCC的分子标志物 | 第135-136页 |
| 6. 生物学功能研究表明PICCOLO影响ESCC的恶性进展 | 第136-141页 |
| 6.1 敲降PCLO减弱ESCC细胞的增殖和克隆形成能力 | 第136-138页 |
| 6.2 敲降PCLO导致ESCC细胞发生G2/M期阻滞 | 第138-139页 |
| 6.3 敲降PCLO抑制ESCC细胞的侵袭和转移能力 | 第139-140页 |
| 6.4 体内实验证明敲降PCLO抑制ESCC细胞的裸鼠成瘤和肺转移能力 | 第140-141页 |
| 7. PICCOLO是EGFR信号通路的重要调控因子 | 第141-147页 |
| 7.1 敲降PCLO促进EGFR内化 | 第141-142页 |
| 7.2 敲降PCLO促进EGFR转位到晚期内吞小体/溶酶体(late endosome/Iysosome) | 第142页 |
| 7.3 敲降PCLO抑制EGFR转位到再循环小体(recycle endosome) | 第142-143页 |
| 7.4 Piccolo影响EGFR的泛素化和蛋白稳定性 | 第143-145页 |
| 7.5 Piccolo负调控E3泛素连接酶Siah1而稳定EGFR的蛋白水平 | 第145-146页 |
| 7.6 Piccolo影响EGFR下游通路的活性 | 第146-147页 |
| 8. 异源表达EGFR能够部分恢复由于PICCOLO下调而导致的ESCC表型改变 | 第147-148页 |
| 9. 利用单克隆抗体靶向PICCOLO作为食管鳞癌潜在的治疗策略 | 第148-151页 |
| 9.1 Piccolo具有膜定位 | 第148-149页 |
| 9.2 Piccolo mAb具有一定的抑制细胞增殖效果 | 第149-151页 |
| 讨论 | 第151-154页 |
| 1. 在基因组层面上发现PCLO存在高频率突变和拷贝数扩增 | 第151页 |
| 2. 在临床应用层面上发现PICCOLO可以作为ESCC预后的分子标志物 | 第151-152页 |
| 3. 在生物学功能层面上发现PICCOLO能够调控ESCC的恶性表型 | 第152页 |
| 4. 在分子机制层面上发现PICCOLO通过调控EGFR的蛋白泛素化水平而影响其在内吞小体中的分选、蛋白稳定性及其下游通路 | 第152-153页 |
| 5. 在靶向治疗层面上发现PICCOLO MAB对ESCC细胞有一定的抑制增殖效果 | 第153-154页 |
| 结论 | 第154-156页 |
| 参考文献 | 第156-159页 |
| 第三部分：p53介导DNA损伤应答相关的microRNAs的筛选研究 | 第159-201页 |
| 缩略语表 | 第160-162页 |
| 中文摘要 | 第162-164页 |
| Abstract | 第164-166页 |
| 前言 | 第166-172页 |
| 材料和方法 | 第172-182页 |
| 1. 实验材料 | 第172-175页 |
| 1.1 实验试剂 | 第172-173页 |
| 1.2 主要仪器 | 第173-174页 |
| 1.3 实验试剂的配制 | 第174-175页 |
| 2. 实验方法 | 第175-182页 |
| 2.1 细胞传代 | 第175页 |
| 2.2 细胞冻存 | 第175-176页 |
| 2.3 UV处理细胞 | 第176页 |
| 2.4 细胞总RNA的提取 | 第176页 |
| 2.5 细胞总蛋白的提取 | 第176-177页 |
| 2.6 蛋白的浓度测定 | 第177页 |
| 2.7 RNA的浓度测定 | 第177页 |
| 2.8 Western Blotting | 第177-178页 |
| 2.9 RT-PCR | 第178-180页 |
| 2.10 生物信息学软件分析差异表达miRNAs | 第180-181页 |
| 2.11 miRNA mimic转染 | 第181页 |
| 2.12 细胞增殖实验 | 第181页 |
| 2.13 细胞克隆形成实验 | 第181页 |
| 2.14 流式细胞分析 | 第181页 |
| 2.15 统计分析 | 第181-182页 |
| 实验结果 | 第182-193页 |
| 1. 紫外线UV-C诱导细胞DNA损伤应答和周期阻滞 | 第182-184页 |
| 2. UV-C照射导致MIRNAs发生差异表达 | 第184-188页 |
| 3. 定位于第13/17号染色体和X染色体的MLRNAs参与UV-C诱导的DNA损伤应答 | 第188-189页 |
| 4. UV-C诱导DNA损伤应答相关MIRNAs参与的通路分析 | 第189-190页 |
| 5. MIR-320A有利于细胞遭受UV-C照射之后的存活 | 第190-193页 |
| 讨论 | 第193-196页 |
| 结论 | 第196-198页 |
| 参考文献 | 第198-201页 |
| 附录 | 第201-213页 |
| 基金资助 | 第213-214页 |
| 在读期间已发表及待发表的英文文章 | 第214-215页 |
| P53相关microRNAs的研究进展(文献综述) | 第215-233页 |
| 参考文献 | 第222-233页 |
| 致谢 | 第233-235页 |
