| 摘要 | 第1-8页 |
| Abstract | 第8-19页 |
| 第一章 引言 | 第19-34页 |
| ·防御素的分类 | 第19-20页 |
| ·β-防御素的结构概述 | 第20-21页 |
| ·不同来源防御素的特征 | 第21-23页 |
| ·防御素的多重生物学活性 | 第23-27页 |
| ·防御素表达系统研究现状 | 第27-29页 |
| ·防御素的应用 | 第29-30页 |
| ·鱼类防御素研究进展 | 第30-33页 |
| ·本研究思路、目的及意义 | 第33-34页 |
| ·研究思路 | 第33页 |
| ·研究目的及意义 | 第33-34页 |
| 第二章 泥鳅防御素基因的克隆 | 第34-53页 |
| ·实验材料 | 第34-36页 |
| ·材料 | 第34页 |
| ·菌株、质粒与引物 | 第34页 |
| ·试剂与工具酶 | 第34页 |
| ·溶液和培养基 | 第34页 |
| ·主要实验仪器 | 第34-36页 |
| ·实验方法 | 第36-44页 |
| ·泥鳅鳃组织总 RNA 的提取 | 第36页 |
| ·第一链 cDNA 合成 | 第36-37页 |
| ·泥鳅基因组 DNA 的提取和纯化 | 第37页 |
| ·防御素基因简并引物的设计 | 第37-38页 |
| ·防御素基因片段的克隆 | 第38-39页 |
| ·防御素完整基因的克隆与分析 | 第39-43页 |
| ·防御素 cDNA 序列和基因组序列分析 | 第43-44页 |
| ·实验结果 | 第44-52页 |
| ·防御素基因简并引物的设计 | 第44页 |
| ·防御素基因片段的克隆 | 第44页 |
| ·防御素完整基因的克隆与分析 | 第44-47页 |
| ·防御素蛋白的分析 | 第47-49页 |
| ·两个防御素基因进化树分析 | 第49-52页 |
| ·讨论 | 第52页 |
| ·小结 | 第52-53页 |
| 第三章 泥鳅防御素在 HEK293T 细胞中的表达及性质测定 | 第53-65页 |
| ·实验材料 | 第53-55页 |
| ·菌株、载体和细胞 | 第53页 |
| ·主要试剂 | 第53页 |
| ·主要试剂的配制 | 第53-54页 |
| ·主要仪器 | 第54-55页 |
| ·实验方法 | 第55-60页 |
| ·引物设计 | 第55页 |
| ·RT-PCR 扩增目的基因 | 第55页 |
| ·重组表达载体的构建 | 第55-56页 |
| ·重组质粒的大量提取 | 第56-57页 |
| ·HEK293T 细胞复苏 | 第57页 |
| ·细胞传代 | 第57页 |
| ·pdBD-pcDNA 及 pcDNA 空载体转染 HEK293T 细胞 | 第57-58页 |
| ·G418 筛选阳性克隆 | 第58页 |
| ·pdBD-1-pcDNA 和 pdBD-2-pcDNA 在细胞中的表达检测 | 第58-59页 |
| ·抑菌活性鉴定 | 第59页 |
| ·数据统计 | 第59-60页 |
| ·实验结果 | 第60-64页 |
| ·目的基因的扩增 | 第60页 |
| ·重组表达载体的构建和鉴定 | 第60页 |
| ·RT-PCR 及 Western blot 检测重组质粒在细胞中的表达 | 第60-62页 |
| ·防御素抑菌活性鉴定 | 第62-64页 |
| ·讨论 | 第64页 |
| ·小结 | 第64-65页 |
| 第四章 泥鳅防御素基因时空表达分析 | 第65-78页 |
| ·实验材料 | 第65-66页 |
| ·材料 | 第65页 |
| ·引物 | 第65页 |
| ·试剂与工具酶 | 第65页 |
| ·主要实验仪器 | 第65-66页 |
| ·实验方法 | 第66-69页 |
| ·实时定量 PCR 引物设计 | 第66页 |
| ·引物特异性的检测及最佳退火温度的摸索 | 第66-67页 |
| ·标准曲线的制作 | 第67页 |
| ·泥鳅不同组织的防御素基因表达差异分析 | 第67页 |
| ·攻毒后防御素基因表达差异分析 | 第67-68页 |
| ·脾脏原代细胞攻毒后的基因表达差异分析 | 第68页 |
| ·数据处理 | 第68-69页 |
| ·实验结果 | 第69-76页 |
| ·引物特异性和最佳退火温度的摸索 | 第69-70页 |
| ·扩增效率检测 | 第70-72页 |
| ·泥鳅防御素不同组织的表达水平差异 | 第72-73页 |
| ·攻毒前后泥鳅防御素表达量的差异 | 第73-74页 |
| ·脾脏原代细胞攻毒结果 | 第74-76页 |
| ·讨论 | 第76-77页 |
| ·小结 | 第77-78页 |
| 第五章 泥鳅防御素亚细胞定位的研究 | 第78-85页 |
| ·实验材料 | 第78-79页 |
| ·菌株、质粒与细胞 | 第78页 |
| ·试剂与工具酶 | 第78页 |
| ·主要实验仪器 | 第78-79页 |
| ·实验方法 | 第79-82页 |
| ·引物设计 | 第79页 |
| ·RT-PCR 扩增目的基因 | 第79页 |
| ·重组表达载体的构建 | 第79-80页 |
| ·pdBD- pDsRed2 重组质粒的大量提取 | 第80页 |
| ·细胞复苏 | 第80页 |
| ·细胞传代 | 第80页 |
| ·pdBD-pDsRed2 及 pDsRed2 空载体瞬时转染 ZF4 细胞 | 第80-81页 |
| ·DAPI 染色 | 第81-82页 |
| ·实验结果 | 第82-84页 |
| ·目的基因的扩增 | 第82页 |
| ·重组表达载体的构建和鉴定 | 第82页 |
| ·pdBD-1 和 pdBD-2 的亚细胞定位 | 第82-84页 |
| ·讨论 | 第84页 |
| ·小结 | 第84-85页 |
| 第六章 斑马鱼防御素互作蛋白的筛选 | 第85-104页 |
| ·实验材料 | 第85-86页 |
| ·材料 | 第85页 |
| ·菌株和质粒 | 第85页 |
| ·试剂和工具酶 | 第85页 |
| ·试剂和培养基的配制 | 第85-86页 |
| ·实验方法 | 第86-96页 |
| ·构建 DNA-BD 融合载体 | 第86页 |
| ·诱饵蛋白的自激活检测 | 第86-87页 |
| ·诱饵蛋白对宿主细胞毒性的检测 | 第87-88页 |
| ·斑马鱼脾脏 cDNA 文库的建立 | 第88-91页 |
| ·文库宿主菌和诱饵菌株的杂交 | 第91页 |
| ·选择表达相互作用蛋白酵母二倍体 | 第91-92页 |
| ·计算融合效率和可筛选的克隆数 | 第92页 |
| ·分析阳性相互作用 | 第92-93页 |
| ·候选蛋白的体内相互作用的初步验证 | 第93-96页 |
| ·实验结果 | 第96-101页 |
| ·诱饵质粒的构建 | 第96页 |
| ·诱饵蛋白自激活的检测 | 第96-97页 |
| ·诱饵蛋白对酵母宿主细胞毒性检测 | 第97页 |
| ·斑马鱼脾脏 cDNA 文库的构建及质量鉴定 | 第97-98页 |
| ·杂交效率的计算及互作蛋白的初步筛选 | 第98-99页 |
| ·体内互作的初步鉴定 | 第99-101页 |
| ·讨论 | 第101-103页 |
| ·小结 | 第103-104页 |
| 第七章 全文结论 | 第104-105页 |
| 参考文献 | 第105-116页 |
| 致谢 | 第116-117页 |
| 作者简历 | 第117页 |
