| 摘要 | 第1-12页 |
| Abstract | 第12-14页 |
| 1 前言 | 第14-21页 |
| ·干扰素的分类 | 第14页 |
| ·IFN-γ的结构及理化性质 | 第14-15页 |
| ·IFN-γ的受体及分布 | 第15页 |
| ·IFN-γ的诱导产生 | 第15页 |
| ·IFN-γ的生物学特性 | 第15-16页 |
| ·IFN-γ的生物学功能 | 第16-18页 |
| ·抗病毒活性 | 第16页 |
| ·抗肿瘤和抗增殖活性 | 第16-17页 |
| ·免疫调节活性 | 第17页 |
| ·抗细菌、寄生虫作用 | 第17-18页 |
| ·治疗类风湿性关节炎 | 第18页 |
| ·治疗皮肤疾病 | 第18页 |
| ·治疗眼科疾病 | 第18页 |
| ·干扰素基因工程研究进展 | 第18-19页 |
| ·大肠杆菌表达系统简介 | 第19页 |
| ·包涵体的形成 | 第19页 |
| ·SUMO 标签的优势 | 第19-20页 |
| ·研究目的及意义 | 第20-21页 |
| 2 材料 | 第21-24页 |
| ·细胞株及菌株 | 第21页 |
| ·载体 | 第21页 |
| ·酶及生化试剂 | 第21页 |
| ·引物 | 第21-22页 |
| ·主要仪器和设备 | 第22-24页 |
| 3 方法 | 第24-35页 |
| ·CaIFN-γ基因的克隆与序列分析 | 第24-28页 |
| ·犬脾总 RNA 的提取 | 第24页 |
| ·CaIFN-γ基因 cDNA 的合成 | 第24-25页 |
| ·CaIFN-γ成熟基因的 PCR 扩增 | 第25页 |
| ·CaIFN-γ PCR 产物胶回收 | 第25页 |
| ·CaIFN-γ胶回收产物与载体 PMD 18 T-Vector 的连接 | 第25-26页 |
| ·E.coil 感受态细胞 DH5α的制备 | 第26页 |
| ·连接产物转化至感受态细胞 DH5α | 第26页 |
| ·重组阳性克隆的筛选 | 第26-27页 |
| ·重组阳性质粒 pMD-CaIFN-γ的鉴定 | 第27页 |
| ·CaIFN-γ成熟多肽基因 cDNA 序列测定与结果分析 | 第27-28页 |
| ·重组表达载体 pSUMO-CaIFN-γ构建 | 第28-29页 |
| ·与 pSUMO 表达载体连接的 CaIFN-γ插入片段的制备 | 第28页 |
| ·CaIFN-γ基因与 SUMO 表达载体的连接 | 第28页 |
| ·重组表达载体的转化 | 第28-29页 |
| ·阳性重组质粒的筛选及鉴定 | 第29页 |
| ·CaIFN-γ蛋白的表达 | 第29-30页 |
| ·pSUMO-CaIFN-γ重组质粒在大肠杆菌中的表达 | 第29页 |
| ·pSUMO-CaIFN-γ重组质粒的诱导条件的优化 | 第29-30页 |
| ·重组 CaIFN-γ融合蛋白表达量分析 | 第30页 |
| ·CaIFN-γ蛋白的纯化 | 第30-31页 |
| ·Ni-NTA 纯化柱的平衡 | 第30-31页 |
| ·融合蛋白的纯化 | 第31页 |
| ·成熟 CaIFN-γ的纯化 | 第31页 |
| ·细胞培养 | 第31-32页 |
| ·细胞复苏 | 第31页 |
| ·细胞传代 | 第31-32页 |
| ·细胞冻存 | 第32页 |
| ·MTT 法检测重组 CaIFN-γ蛋白对 MDCK 增殖的抑制作用 | 第32页 |
| ·Annexin V/PI 双染法检测 CaIFN-γ蛋白诱导 MDCK 细胞凋亡 | 第32页 |
| ·Real-time PCR 检测 CaIFN-γ蛋白对调 MDCK 细胞 p53 mRNA 水平的影响 | 第32-35页 |
| 4 结果 | 第35-45页 |
| ·CaIFN-γ基因的克隆与序列分析 | 第35-37页 |
| ·犬脾 CDNA 的获得 | 第35页 |
| ·CaIFN-γ基因 cDNA 的 RT-PCR 扩增 | 第35-36页 |
| ·重组质粒 pMD-CaIFN-γ的鉴定 | 第36页 |
| ·阳性重组质粒 pMD-CaIFN-γ的测序结果分析 | 第36-37页 |
| ·重组表达载体 pSUMO-CaIFN-γ构建 | 第37-38页 |
| ·CaIFN-γ插入片段的胶回收 | 第37页 |
| ·阳性重组质粒的鉴定 | 第37-38页 |
| ·CaIFN-γ蛋白的表达 | 第38-41页 |
| ·重组质粒 pSUMO-CaIFN-γ转化菌的诱导 | 第38-39页 |
| ·CaIFN-γ蛋白诱导条件的优化 | 第39-41页 |
| ·重组 CaIFN-γ融合蛋白表达量分析 | 第41页 |
| ·CaIFN-γ蛋白的纯化 | 第41-42页 |
| ·融合蛋白的纯化 | 第41页 |
| ·pSUMO-CaIFN-γ成熟蛋白的纯化 | 第41-42页 |
| ·MTT 法检测重组 CaIFN-γ蛋白对 MDCK 增殖的抑制作用 | 第42-43页 |
| ·流式细胞仪检测 CaIFN-γ蛋白诱导 MDCK 细胞发生凋亡和坏死 | 第43页 |
| ·Real-time PCR 检测 CaIFN-γ蛋白上调 MDCK 细胞 p53mRNA 表达水 | 第43-45页 |
| 5 讨论 | 第45-51页 |
| ·蛋白的可溶性表达 | 第45-46页 |
| ·培养条件对蛋白表达量的影响 | 第46-47页 |
| ·CaIFN-γ蛋白生物活性的检测 | 第47-50页 |
| ·干扰素检测的传统方法 | 第47-48页 |
| ·MTT 方法检测 CaIFN-γ抑制 MDCK 细胞增殖，并促进其凋亡 | 第48-49页 |
| ·应用 Annexin V/PI 双染法检测 CaIFN-γ蛋白对 MDCK 细胞发生凋亡和坏死的影响 | 第49页 |
| ·CaIFN-γ上调 MDCK 细胞内 P53 的表达 | 第49-50页 |
| ·展望 | 第50-51页 |
| 6 结论 | 第51-52页 |
| 致谢 | 第52-53页 |
| 参考文献 | 第53-56页 |
| 附录 A | 第56-57页 |
| 附录 B | 第57-58页 |
| 附录 C | 第58-59页 |
| 攻读学位期间发表的学位论文 | 第59页 |
