| 中文摘要 | 第1-10页 |
| 英文摘要 | 第10-11页 |
| 第一部分 文献综述和立题意义 | 第11-33页 |
| Ⅰ 综述 | 第11-29页 |
| 一、基因克隆的主要策略 | 第11-13页 |
| 1、功能克隆 | 第11页 |
| 2、表型克隆 | 第11-12页 |
| 3、定位克隆 | 第12-13页 |
| 4、序列克隆 | 第13页 |
| 二、基因克隆的常用技术 | 第13-18页 |
| 1、PCR技术 | 第13-14页 |
| 2、基因标记法 | 第14页 |
| 3、mRNA差异显示 | 第14-15页 |
| 4、消减杂交法 | 第15页 |
| 5、基因芯片技术 | 第15-16页 |
| 6、电子克隆技术 | 第16-17页 |
| 7、基因文库技术 | 第17-18页 |
| 三、大片段DNA插入文库的发展史 | 第18-22页 |
| 1、质粒文库 | 第18页 |
| 2、λ噬菌体文库 | 第18页 |
| 3、粘粒文库 | 第18-19页 |
| 4、酵母人工染色体(YAC)文库 | 第19-20页 |
| 5、细菌人工染色体(BAC)文库 | 第20页 |
| 6、P1克隆系统和源于P1的人工染色体(PAC)文库 | 第20-21页 |
| 7、双元细菌人工染色体(BIBAC)文库 | 第21-22页 |
| 8、可转化人工染色体(TAC)文库 | 第22页 |
| 四、可转化人工染色体(TAC)文库的发展史 | 第22-27页 |
| 五、大片段基因组文库的筛选方法 | 第27-28页 |
| 六、多枝赖草的研究现状 | 第28-29页 |
| Ⅱ 本论文立题依据、研究内容、技术路线 | 第29-33页 |
| 一、立题依据 | 第29页 |
| 二、研究内容 | 第29-32页 |
| 三、技术路线 | 第32-33页 |
| 第二部分 多枝赖草基因组可转化人工染色体(TAC)文库的构建、鉴定和筛选 | 第33-108页 |
| 材料与方法 | 第33-75页 |
| 一、实验材料 | 第33-36页 |
| 1、多枝赖草 | 第33页 |
| 2、pYLTAC17和pYLTAC747H质粒载体 | 第33-34页 |
| 3、大肠杆菌感受态细胞 | 第34页 |
| 4、农杆菌感受态细胞LB4404 | 第34页 |
| 5、叶绿体和线粒体DNA探针 | 第34页 |
| 6、谷胱甘肽还原酶 | 第34-35页 |
| 7、多枝赖草抗逆EST | 第35页 |
| 8、主要仪器 | 第35页 |
| 9、主要试剂和溶液 | 第35-36页 |
| 二、实验方法 | 第36-75页 |
| 1、多枝赖草基因组TAC文库的构建 | 第36-63页 |
| ·、pYLTAC17和pYLTAC747H两种TAC载体的制备 | 第36-41页 |
| ·、pYLTAC17和pYLTAC747H质粒载体的分离、纯化和浓度估测 | 第36-38页 |
| ·、电激转化大肠杆菌感受态细胞检测TAC质粒载体 | 第38页 |
| ·、闭环TAC载体DNA不同酶用量梯度的酶切和脱磷 | 第38-41页 |
| ·、线性TAC载体DNA脱磷效果的自连检测 | 第41页 |
| ·、多枝赖草的2Mb以上核DNA制备 | 第41-46页 |
| ·、细胞核的提取和镜检 | 第42-43页 |
| ·、细胞核的低溶点琼脂糖胶块包埋 | 第43页 |
| ·、蛋白酶K裂解LMP胶中细胞核 | 第43-44页 |
| ·、含高分子量核DNA的琼脂糖胶块清洗及保存 | 第44页 |
| ·、琼脂糖胶块中高分子量核DNA质量、大小和浓度的测定 | 第44-45页 |
| ·、2Mb以上核DNA的回收纯化及保存 | 第45-46页 |
| ·、多枝赖草2Mb以上核DNA的酶切和酶切片段的回收 | 第46-52页 |
| ·、部分酶切最佳酶用量的确定 | 第46-47页 |
| ·、2Mb以上核DNA的大量酶切 | 第47-48页 |
| ·、酶切片段的选择 | 第48-49页 |
| ·、选择片段的电洗脱回收 | 第49-50页 |
| ·、DNA片段的浓缩、纯化和脱盐 | 第50页 |
| ·、检测DNA大小和纯度 | 第50-52页 |
| ·、多枝赖草DNA片段与TAC载体的连接反应 | 第52-57页 |
| ·、两种线性TAC载体DNA与选择片段的比例确定 | 第52-55页 |
| ·、连接反应条件的优化 | 第55-56页 |
| ·、连接产物的脱盐纯化 | 第56页 |
| ·、连接产物的浓度测定 | 第56-57页 |
| ·、连接产物导入大肠杆菌和阳性克隆的筛选 | 第57-60页 |
| ·、大肠杆菌DH10B感受态细胞的制备 | 第57-58页 |
| ·、连接反应产物电转化导入大肠杆菌DH10B感受态细胞 | 第58-59页 |
| ·、选择培养基中最佳涂板量的确定 | 第59-60页 |
| ·、阳性克隆的筛选 | 第60页 |
| ·、阳性克隆的初步鉴定分析 | 第60页 |
| ·、多枝赖草TAC文库的保存 | 第60-63页 |
| ·、阳性克隆菌落收集统计 | 第60-61页 |
| ·、单克隆文库的保存 | 第61页 |
| ·、混合克隆文库的保存 | 第61-62页 |
| ·、TAC文库的贮藏与备份 | 第62-63页 |
| 2、多枝赖草TAC文库的鉴定和分析 | 第63-69页 |
| ·、TAC克隆的限制性酶切分析 | 第63-65页 |
| ·、文库中TAC克隆的恢复培养 | 第63-64页 |
| ·、TAC克隆的质粒提取 | 第64页 |
| ·、HindⅢ酶切分析TAC克隆质粒中插入DNA片段的大小 | 第64页 |
| ·、继代培养分析TAC克隆质粒的稳定性 | 第64-65页 |
| ·、叶绿体和线粒体DNA污染分析 | 第65-68页 |
| ·、含叶绿体高梁psbA,线粒体玉米atp6和atp9基因的菌液培养 | 第65页 |
| ·、含叶绿体高梁psbA,线粒体玉米atp6和atp9基因质粒的酶切和回收 | 第65-66页 |
| ·、叶绿体高梁psbA,线粒体玉米atp6和atp9基因探针的DIG标记 | 第66-67页 |
| ·、斑点杂交检测叶绿体和线粒体DNA的污染 | 第67-68页 |
| ·、TAC克隆在大肠杆菌和农杆菌中的稳定性鉴定 | 第68-69页 |
| ·、农杆菌菌株LBA4404感受态细胞的制备 | 第68页 |
| ·、大肠杆菌DH10B菌液中TAC克隆质粒的提取 | 第68-69页 |
| ·、TAC克隆质粒电转化导入农杆菌菌株LBA4404感受态细胞 | 第69页 |
| ·、农杆菌菌株LBA4404菌液中TAC克隆质粒的提取 | 第69页 |
| ·、TAC克隆质粒重新电转化导入大肠杆菌DH10B感受态细胞 | 第69页 |
| ·、大肠杆菌和农杆菌中TAC克隆质粒的HindⅢ酶切分析 | 第69页 |
| 3、多枝赖草TAC文库的筛选 | 第69-75页 |
| ·、高密度杂交膜的制备 | 第69-72页 |
| ·、杂交膜的准备 | 第70页 |
| ·、杂交膜的机器手GeneTAC~(TM) G3点样 | 第70-71页 |
| ·、膜上TAC克隆的培养、固定和裂解 | 第71-72页 |
| ·、多枝赖草谷胱甘肽还原酶基因(GR)的筛选 | 第72-73页 |
| ·、克隆菌5'RACE-GR和3'RACE-GR的质粒DNA获得 | 第72页 |
| ·、胶中克隆菌5'RACE-GR和3'RACE-GR的DNA片段回收 | 第72页 |
| ·、5'RACE-GR和3'RACE-GR的DNA片段的DIG标记 | 第72-73页 |
| ·、谷胱甘肽还原酶基因探针与高密度膜的Southern杂交 | 第73页 |
| ·多枝赖草特异抗性基因EST的电子克隆与筛选 | 第73-75页 |
| ·、抗性基因EST在数据库中检索 | 第73页 |
| ·、检索选择后EST的Contig | 第73-74页 |
| ·、Contig新序列的循环检索和拼接延伸 | 第74页 |
| ·、设计不能再延伸的序列DNA的PCR引物 | 第74页 |
| ·、用PCR-Pool法筛选混合克隆TAC文库 | 第74-75页 |
| 实验结果与分析 | 第75-102页 |
| Ⅰ、多枝赖草基因组TAC文库的构建 | 第75-90页 |
| 一、pYLTAC17和pYLTAC747H两种TAC载体的制备 | 第75-76页 |
| 1、TAC质粒载体的分离、纯化和浓度估测 | 第75-76页 |
| 2、闭环TAC载体DNA不同酶用量梯度的酶切 | 第76页 |
| 二、多枝赖草的2Mb以上核DNA制备 | 第76-80页 |
| 1、多枝赖草的培养 | 第76-77页 |
| 2、细胞核的分离和镜检 | 第77-78页 |
| 3、蛋白酶K裂解LMP胶中的细胞核 | 第78页 |
| 4、琼脂糖胶块中高分子量核DNA质量、大小和浓度的测定 | 第78-79页 |
| 5、2Mb以上核DNA的回收纯化及保存 | 第79-80页 |
| 三、多枝赖草2Mb以上核DNA的酶切和酶切片段的回收 | 第80-84页 |
| 1、多枝赖草2Mb以上核DNA的部分酶切最佳酶用量的确定 | 第80-81页 |
| 2、2Mb以上核DNA的大量酶切 | 第81页 |
| 3、酶切片段的选择 | 第81-82页 |
| 4、选择DNA片段的电洗脱回收 | 第82-83页 |
| 5、DNA片段的浓缩、纯化和大小估测 | 第83-84页 |
| 四、多枝赖草DNA片段与TAC载体的连接反应 | 第84-86页 |
| 1、两种线性TAC载体DNA与选择片段的比例确定 | 第84页 |
| 2、连接反应条件的优化 | 第84-85页 |
| 3、连接产物的脱盐纯化和浓度测定 | 第85-86页 |
| 五、连接产物导入大肠杆菌和阳性克隆的筛选 | 第86-89页 |
| 1、连接反应产物对电转化的影响 | 第86-87页 |
| 2、选择培养基中最佳涂板量的确定 | 第87-88页 |
| 3、阳性克隆的筛选 | 第88-89页 |
| 六、多枝赖草TAC文库的保存 | 第89-90页 |
| 1、TAC文库的保存与培养 | 第89页 |
| 2、多枝赖草基因组可转化人工染色体(TAC)文库概况 | 第89-90页 |
| 3、所建多枝赖草基因组TAC文库的管理 | 第90页 |
| Ⅱ、多枝赖草TAC文库的鉴定和分析 | 第90-93页 |
| 一、TAC克隆的限制性酶切分析 | 第90-92页 |
| 1、文库基因组的覆盖率、插入片段大小及空载率的鉴定 | 第90-91页 |
| 2、继代培养分析TAC克隆质粒的稳定性 | 第91-92页 |
| 二、叶绿体和线粒体DNA污染分析 | 第92-93页 |
| 三、TAC克隆在大肠杆菌和农杆菌中的稳定性鉴定 | 第93页 |
| Ⅲ、多枝赖草TAC文库的筛选 | 第93-102页 |
| 一、高密度杂交膜的制备 | 第93-95页 |
| 1、杂交膜的机器手GeneTAC~(TM) G3点样和培养 | 第93-94页 |
| 2、菌斑裂解和DNA与膜的结合 | 第94-95页 |
| 3、高密度杂交膜和文库的检测 | 第95页 |
| 二、多枝赖草谷胱甘肽还原酶基因(GR)的筛选 | 第95-96页 |
| 三、多枝赖草特异抗性基因EST的电子克隆与筛选 | 第96-102页 |
| 1、多枝赖草的耐蚜虫、耐黄矮病性状相关的EST序列的电子克隆 | 第96-98页 |
| 2、多枝赖草的盐胁迫、耐盐、耐旱性状相关的EST序列的电子克隆 | 第98-101页 |
| 3、电子克隆序列的PCR引物设计 | 第101页 |
| 4、TAC文库的PCR-Pool法筛选 | 第101-102页 |
| 讨论 | 第102-107页 |
| 一、TAC载体的选择和制备 | 第102-103页 |
| 二、多枝赖草材料的选择 | 第103页 |
| 三、核DNA的制备 | 第103-104页 |
| 四、连接条件的优化 | 第104页 |
| 五、电击转化效率的优化 | 第104-105页 |
| 六、多枝赖草TAC文库的鉴定 | 第105-106页 |
| 七、多枝赖草TAC文库的筛选 | 第106-107页 |
| 结论 | 第107-108页 |
| 附录 | 第108-110页 |
| 参考文献 | 第110-119页 |
| 个人简历 | 第119-120页 |
| 致谢 | 第120页 |
