| 摘要 | 第1-4页 |
| Abstract | 第4-8页 |
| 第一章 前言 | 第8-27页 |
| 1 碱性成纤维细胞生长因子 bFGF 蛋白的研究进展 | 第8-15页 |
| ·bFGF 的结构 | 第8-9页 |
| ·bFGF 的药理作用 | 第9-11页 |
| ·bFGF 在创伤愈合及软骨组织的修复作用 | 第9-10页 |
| ·bFGF 与心血管疾病关系 | 第10页 |
| ·bFGF 对神经系统的营养作用 | 第10-11页 |
| ·bFGF 与肿瘤的关系 | 第11页 |
| ·bFGF 的作用机理 | 第11-13页 |
| ·bFGF 的重组生产 | 第13-14页 |
| ·展望 | 第14-15页 |
| 2 巴斯德毕赤酵母表达系统及其分泌型蛋白表达的研究进展 | 第15-24页 |
| ·表达系统的主要特征 | 第15-16页 |
| ·表达系统的组成 | 第16-18页 |
| ·表达载体 | 第16-18页 |
| ·启动子 | 第17-18页 |
| ·选择标记 | 第18页 |
| ·表达载体的种类 | 第18页 |
| ·巴斯德毕赤酵母菌株类型 | 第18-19页 |
| ·巴斯德毕赤酵母的表型 | 第18-19页 |
| ·蛋白酶缺陷型毕赤酵母 | 第19页 |
| ·分泌型外源蛋白的修饰 | 第19-20页 |
| ·信号肽及其选择 | 第19-20页 |
| ·外源蛋白的糖基化作用 | 第20页 |
| ·提高外源蛋白表达量的策略 | 第20-23页 |
| ·优化基因内部结构 | 第20-21页 |
| ·分泌信号的改造 | 第21-22页 |
| ·选择高表达的启动子 | 第22页 |
| ·筛选高拷贝转化子 | 第22-23页 |
| ·优化表达条件 | 第23页 |
| ·提高菌株的生物量 | 第23页 |
| ·降低外源蛋白的降解 | 第23页 |
| ·应用前景及局限性 | 第23-24页 |
| 3 本研究的目的与意义 | 第24-25页 |
| 4 实验技术路线 | 第25-26页 |
| 5 酵母表达载体 bFGF/pGAPZα-A 图谱 | 第26-27页 |
| 第二章 材料与方法 | 第27-44页 |
| 1. 实验材料 | 第27-29页 |
| ·菌株和质粒 | 第27-28页 |
| ·分子生物学实验常用酶和试剂盒 | 第28页 |
| ·分子生物学常用试剂 | 第28页 |
| ·常用培养基配方 | 第28-29页 |
| ·主要仪器设备 | 第29页 |
| 2 实验方法 | 第29-44页 |
| ·引物设计与合成 | 第29页 |
| ·bFGF 基因的克隆 | 第29-31页 |
| ·PCR 扩增bFGF 基因(朱平，1992) | 第29-30页 |
| ·PCR 扩增产物回收 | 第30-31页 |
| ·克隆载体的构建及鉴定(黄培堂，2002；颜子颖，王海林，1998) | 第31-34页 |
| ·PCR 回收产物与克隆载体T-easy Vector(pMD19-T Vector)的连接 | 第31页 |
| ·E. coli DH5α感受态细胞的制备 | 第31页 |
| ·连接产物转化感受态细胞 | 第31-32页 |
| ·质粒制备和纯化(文中所有质粒操作均按以下方法) | 第32-33页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第33页 |
| ·bFGF 基因的序列测定 | 第33-34页 |
| ·表达载体的构建及鉴定 | 第34-35页 |
| ·hu-bFGF 基因的制备 | 第34页 |
| ·表达载体pGAPZα-A 的制备 | 第34页 |
| ·bFGF 基因与表达载体的连接 | 第34页 |
| ·连接产物的转化及鉴定 | 第34-35页 |
| ·bFGF 基因的序列测定 | 第35页 |
| ·工程菌GS115/pGAPZα-A/hu-bFGF 的构建与筛选 | 第35-37页 |
| ·pGAPZα-A/hu-bFGF 质粒的制备 | 第35页 |
| ·电转化法酵母GS115 感受态细胞的制备 | 第35-36页 |
| ·电转化 | 第36页 |
| ·重组菌株PCR 鉴定 | 第36-37页 |
| ·酵母的诱导表达 | 第37页 |
| ·SDS-PAGE 电泳检测和筛选 | 第37-39页 |
| ·发酵上清液处理 | 第37页 |
| ·发酵产物SDS-PAGE 电泳（汪家政，范明，2002） | 第37-39页 |
| ·SDS-PAGE 凝胶进行扫描 | 第39页 |
| ·Zeocin 高抗性转化子的筛选 | 第39页 |
| ·发酵条件的优化 | 第39-41页 |
| ·最适发酵培养基种类 | 第39页 |
| ·最适发酵时间 | 第39页 |
| ·最佳培养基配方 | 第39-40页 |
| ·最适初始pH | 第40页 |
| ·最适接种量 | 第40-41页 |
| ·最适装液量 | 第41页 |
| ·发酵上清液中蛋白含量的测定 | 第41-42页 |
| ·总蛋白含量的测定 | 第41页 |
| ·各优化条件对hu-bFGF 表达的SDS-PAGE 分析 | 第41-42页 |
| ·重组蛋白净含量测定方法 | 第42页 |
| ·Western blot 分析 | 第42-44页 |
| 第三章 结果与分析 | 第44-56页 |
| 1 bFGF 基因的克隆、鉴定和测序 | 第44-46页 |
| ·bFGF 基因的PCR 扩增 | 第44页 |
| ·克隆载体pMD19-T/hu-bFGF 的构建与鉴定 | 第44-45页 |
| ·表达载体pGAPZα-A/hu-bFGF 的构建与鉴定 | 第45-46页 |
| 2 酵母的转化和重组酵母的PCR 鉴定 | 第46-47页 |
| 3 Zeocin 高抗性转化子的筛选与鉴定 | 第47-48页 |
| ·Zeocin 高抗性转化子的筛选 | 第47页 |
| ·Zeocin 高抗性转化子摇瓶表达hu-bFGF | 第47-48页 |
| 4 工程菌发酵条件的优化 | 第48-53页 |
| ·最适发酵培养基种类 | 第48-49页 |
| ·最适发酵时间 | 第49页 |
| ·最佳培养基配方 | 第49-51页 |
| ·最适碳源 | 第49页 |
| ·最适麦芽糖浓度 | 第49-50页 |
| ·最适酵母浸出粉浓度 | 第50页 |
| ·最适蛋白胨浓度 | 第50-51页 |
| ·最适初始pH | 第51-52页 |
| ·最适接种量 | 第52-53页 |
| ·最适装液量 | 第53页 |
| 5 发酵上清液中蛋白含量的测定 | 第53-55页 |
| 6 Western blot 分析 | 第55-56页 |
| 第四章 讨论 | 第56-60页 |
| 1 bFGF 的临床应用前景和存在问题 | 第56页 |
| 2 酵母表达系统的优越性 | 第56-57页 |
| 3 电转化法 | 第57-58页 |
| 4 表达条件的优化 | 第58页 |
| 5 本研究今后的主要研究任务 | 第58-60页 |
| 第五章 结论 | 第60-61页 |
| 参考文献 | 第61-69页 |
| 缩略语表 | 第69-71页 |
| 致谢 | 第71-72页 |
| 附图 | 第72-73页 |
