| 摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-15页 |
| 1 前言 | 第15-26页 |
| ·哈维氏弧菌 | 第15页 |
| ·哈维氏弧菌的致病机理 | 第15-17页 |
| ·粘附作用 | 第15-16页 |
| ·侵袭宿主 | 第16-17页 |
| ·哈维氏弧菌的检测技术 | 第17-19页 |
| ·分子生物学方法 | 第17-18页 |
| ·免疫诊断技术 | 第18-19页 |
| ·寡肽透性酶(Opp) | 第19-21页 |
| ·磷脂酶C | 第21-24页 |
| ·磷脂酶C 的结构 | 第21-22页 |
| ·磷脂酶C 的活化机制 | 第22页 |
| ·磷脂酶C的检测方法 | 第22-24页 |
| ·卵黄平板法 | 第23页 |
| ·NPPC 法 | 第23页 |
| ·定磷法 | 第23页 |
| ·游离脂肪酸法 | 第23页 |
| ·薄层层析法 | 第23-24页 |
| ·放射性标记法 | 第24页 |
| ·本论文研究的目的和意义 | 第24-26页 |
| 2 哈维氏弧菌oppA 原核表达体系及其突变菌株的构建 | 第26-51页 |
| ·材料与方法 | 第26-38页 |
| ·材料与仪器 | 第26-28页 |
| ·菌株 | 第26页 |
| ·质粒 | 第26页 |
| ·主要试剂 | 第26页 |
| ·主要培养基及配制 | 第26-27页 |
| ·主要仪器 | 第27页 |
| ·主要试剂的配制 | 第27-28页 |
| ·哈维氏弧菌oppA 的克隆及鉴定 | 第28-32页 |
| ·哈维氏弧菌基因组DNA 的提取 | 第28页 |
| ·PCR 扩增哈维氏弧菌oppA | 第28-29页 |
| ·引物设计 | 第28-29页 |
| ·PCR 反应体系 | 第29页 |
| ·PCR 产物的纯化与回收 | 第29页 |
| ·质粒与DNA 连接 | 第29-30页 |
| ·感受态细胞的制备（CaC12 法.） | 第30页 |
| ·质粒的转化 | 第30-31页 |
| ·质粒的提取 | 第31-32页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第32页 |
| ·测序 | 第32页 |
| ·序列分析 | 第32页 |
| ·哈维氏弧菌oppA 的表达和纯化 | 第32-34页 |
| ·表达引物的设计与合成 | 第32页 |
| ·哈维氏弧菌oppA 的表达 | 第32-33页 |
| ·pET-28a(+)/oppA 表达质粒的构建与鉴定 | 第33页 |
| ·oppA 在大肠杆菌BL21 中表达条件的优化 | 第33-34页 |
| ·重组菌BL21/pET-28a(+)/oppA 的扩大培养及胞内、胞外产物的制备 | 第34页 |
| ·Ni 琼脂糖亲和柱亲和层析 | 第34页 |
| ·oppA 重组表达蛋白的SDS-PAGE 电泳检测 | 第34页 |
| ·哈维氏弧菌oppA 突变株的构建 | 第34-37页 |
| ·oppA 基因部分同源片段的制备 | 第35页 |
| ·oppA 基因部分同源片段的克隆 | 第35页 |
| ·自杀质粒的制备 | 第35页 |
| ·重组质粒和自杀质粒双酶切和纯化 | 第35-36页 |
| ·细菌结合实验 | 第36-37页 |
| ·PCR 法鉴定哈维氏弧菌oppA 基因突变株 | 第37页 |
| ·哈维氏弧菌野生株与oppA 基因突变株性质对比研究 | 第37-38页 |
| ·哈维氏弧菌野生株和突变株生长曲线的比较 | 第37页 |
| ·哈维氏弧菌野生株和突变株毒性实验 | 第37-38页 |
| ·结果 | 第38-49页 |
| ·哈维氏弧菌oppA 的克隆 | 第38-40页 |
| ·哈维氏弧菌基因组DNA 的提取 | 第38页 |
| ·哈维氏弧菌oppA 的PCR 扩增 | 第38-39页 |
| ·目的片段的纯化和回收 | 第39页 |
| ·阳性克隆鉴定 | 第39-40页 |
| ·测序结果与序列分析 | 第40-44页 |
| ·测序结果 | 第40-42页 |
| ·序列分析 | 第42-44页 |
| ·哈维氏弧菌OppA的表达及纯化 | 第44-47页 |
| ·目的基因的PCR 扩增 | 第44页 |
| ·表达质粒pET-28a(+)和目的片段的纯化和回收 | 第44-45页 |
| ·表达载体pET-28a(+)和目的片段的连接和转化大肠杆菌 | 第45-46页 |
| ·重组蛋白表达条件的优化 | 第46页 |
| ·重组蛋白oppA 的纯化 | 第46-47页 |
| ·哈维氏弧菌oppA 突变株的构建 | 第47-48页 |
| ·oppA 基因部分编码区的扩增 | 第47页 |
| ·哈维氏弧菌oppA 突变株的鉴定 | 第47-48页 |
| ·哈维氏弧菌oppA 基因突变株性质分析 | 第48-49页 |
| ·哈维氏弧菌野生株和突变株生长曲线的测定 | 第48页 |
| ·哈维氏弧菌野生株和突变株的毒性试验 | 第48-49页 |
| ·讨论 | 第49-51页 |
| 3 哈维氏弧菌oppA 磷脂酶 C 性质的研究及多抗的制备 | 第51-61页 |
| ·材料与方法 | 第51-56页 |
| ·材料与仪器 | 第51页 |
| ·p-NPPC 法测定oppA 磷脂酶C 活力 | 第51-53页 |
| ·对硝基苯酚标准曲线的制作 | 第51-52页 |
| ·oppA 磷脂酶C 活力的测定 | 第52-53页 |
| ·Bradford 法测定蛋白质浓度 | 第53-54页 |
| ·考马斯亮蓝试剂 | 第53页 |
| ·标准蛋白质溶液 | 第53页 |
| ·标准曲线的制作 | 第53-54页 |
| ·样品蛋白质浓度测定 | 第54页 |
| ·寡肽结合蛋白磷脂酶C 性质研究 | 第54-55页 |
| ·oppA 磷脂酶C 最适反应温度的测定 | 第54页 |
| ·温度对oppA 磷脂酶C 稳定性的影响 | 第54页 |
| ·oppA磷脂酶C最适pH值的测定 | 第54页 |
| ·pH值对oppA磷脂酶C稳定性的影响 | 第54页 |
| ·oppA 卵磷脂酶活性检测 | 第54页 |
| ·oppA 溶血活性检测 | 第54-55页 |
| ·多克隆抗体的制备及其效价检测 | 第55-56页 |
| ·兔抗oppA 多抗的制备 | 第55页 |
| ·琼脂扩散法检测兔血清抗体效价 | 第55页 |
| ·oppA 与其抗血清的Western Blot 检测 | 第55-56页 |
| ·结果 | 第56-60页 |
| ·寡肽结合蛋白磷脂酶C 性质的研究 | 第56-58页 |
| ·温度对oppA 磷脂酶C 活性的影响 | 第56-57页 |
| ·pH对oppA磷脂酶C活性的影响 | 第57-58页 |
| ·重组蛋白oppA 卵磷脂活性及溶血活性检测 | 第58页 |
| ·琼脂糖扩散法检测兔抗oppA 效价 | 第58-59页 |
| ·Western Blot 检测 | 第59-60页 |
| ·讨论 | 第60-61页 |
| 结论 | 第61-62页 |
| 参考文献 | 第62-66页 |
| 附录 Ⅰ | 第66-68页 |
| 致谢 | 第68-69页 |
| 个人简历 | 第69页 |
| 发表和撰写的文章 | 第69页 |
