| 摘要 | 第1-10页 |
| Abstract | 第10-12页 |
| 英文缩写表 | 第12-13页 |
| 第一章 前言 | 第13-41页 |
| ·朊病毒分子生物学 | 第13-17页 |
| ·致病性朊病毒的发现及其化学本质的研究 | 第13-14页 |
| ·PrP基因 | 第14页 |
| ·朊病毒蛋白的一级结构 | 第14-15页 |
| ·朊病毒蛋白的高级结构 | 第15-16页 |
| ·朊病毒的致病机理 | 第16-17页 |
| ·抗PrP~(sc)及PrP~c的抗体研制现状 | 第17-19页 |
| ·朊病毒疾病的检测 | 第19-23页 |
| ·病理检测 | 第19页 |
| ·免疫诊断 | 第19-21页 |
| ·其他诊断方法 | 第21-23页 |
| ·展望 | 第23页 |
| ·基因工程抗体研究进展 | 第23-33页 |
| ·基因工程抗体的种类 | 第24-27页 |
| ·单链抗体的改进 | 第27页 |
| ·双特异抗体 | 第27-28页 |
| ·基因工程抗体融合蛋白 | 第28页 |
| ·基因工程抗体库技术 | 第28-31页 |
| ·基因工程抗体的应用及展望 | 第31-33页 |
| ·蛋白芯片研究进展 | 第33-40页 |
| ·蛋白芯片的分类 | 第34-35页 |
| ·载体的选择 | 第35页 |
| ·蛋白质的固定 | 第35-37页 |
| ·蛋白质的标记及检测方法 | 第37-38页 |
| ·蛋白芯片的应用 | 第38-40页 |
| ·课题的研究意义及内容 | 第40-41页 |
| 第二章 重组牛朊蛋白的高效表达及活性鉴定 | 第41-55页 |
| ·前言 | 第41页 |
| ·材料与方法 | 第41-48页 |
| ·菌株和质粒 | 第41-42页 |
| ·酶和试剂 | 第42-43页 |
| ·培养基 | 第43页 |
| ·牛总DNA的提取 | 第43页 |
| ·PCR扩增牛PrP~c(bPrP~c)基因和牛PrP~c核心区(bPrP27-30)基因片断 | 第43-44页 |
| ·DNA序列测定 | 第44页 |
| ·bPrP~c基因和bPrP27-30基因片断克隆载体的构建 | 第44页 |
| ·bPrP~c基因和bPrP27-30基因片断表达载体的构建 | 第44-45页 |
| ·大肠杆菌感受态的制备 | 第45页 |
| ·大肠杆菌的转化 | 第45页 |
| ·大肠杆菌质粒的提取 | 第45页 |
| ·硫氧还蛋白-牛朊蛋白融合蛋白(TrxA-bPrP~c)和硫氧还蛋白-牛朊蛋白核心区(TrxA-bPrP27-30)融合蛋白的诱导表达 | 第45-47页 |
| ·TrxA-bPrP~c和TrxA-bPrP27-30融合蛋白的亲和纯化 | 第47-48页 |
| ·Western Blot鉴定重组bPrP~c和bPrP27-30蛋白的抗原活性 | 第48页 |
| ·SDS-PAGE分析蛋白质纯度及分子量 | 第48页 |
| ·结果与分析 | 第48-53页 |
| ·bPrP~c基因和bPrP27-30基因片断的克隆 | 第48-49页 |
| ·bPrP~c基因和bPrP27-30基因片断克隆到T载体 | 第49页 |
| ·bPrP~c基因和bPrP27-30基因片断的序列测定结果 | 第49页 |
| ·bPrP~c基因和bPrP27-30基因片断表达载体的鉴定 | 第49-50页 |
| ·TrxA-bPrP~c和TrxA-bPrP27-30的高效表达和纯化 | 第50-52页 |
| ·重组bPrP~c基因和bPrP27-30基因片断表达产物的Western Blot鉴定 | 第52-53页 |
| ·讨论 | 第53-54页 |
| ·TrxA-bPrP~c和TrxA-bPrP27-30的高效表达 | 第53-54页 |
| ·温度对融合蛋白TrxA-bPrP~c和TrxA-bPrP27-30表达的影响 | 第54页 |
| ·融合蛋白的Western blot鉴定 | 第54页 |
| ·结论 | 第54-55页 |
| 第三章 噬菌体抗体库技术筛选抗牛朊蛋白单链抗体 | 第55-77页 |
| ·前言 | 第55页 |
| ·材料与方法 | 第55-64页 |
| ·试剂与材料 | 第55-56页 |
| ·菌株 | 第56页 |
| ·质粒载体 | 第56-57页 |
| ·PCR引物 | 第57页 |
| ·培养基 | 第57-58页 |
| ·实验程序 | 第58-59页 |
| ·动物免疫 | 第59页 |
| ·血清效价测定 | 第59页 |
| ·抗体总RNA提取 | 第59页 |
| ·第一链cDNA反转录合成 | 第59-60页 |
| ·轻、重链基因的扩增 | 第60页 |
| ·scFv DNA的组装与扩增 | 第60-61页 |
| ·scFv DNA片断的sfiⅠ／NotⅠ酶切 | 第61页 |
| ·大肠杆菌TG1感受态的制备 | 第61-62页 |
| ·pCANTAB 5E-scFv重组质粒的构建 | 第62-63页 |
| ·重组噬菌体的制备 | 第63页 |
| ·单链抗体噬菌体抗体库的富集筛选(panning)(微孔板筛选法) | 第63-64页 |
| ·用ELISA方法检测抗牛朊蛋白的单链抗体 | 第64页 |
| ·ScFv的序列分析 | 第64页 |
| ·结果与分析 | 第64-73页 |
| ·牛朊蛋白抗血清效价测定 | 第64-65页 |
| ·重链、轻链可变区基因(V_H、V_L)的扩增及产物的鉴定 | 第65-66页 |
| ·scFv基因拼接产物的鉴定 | 第66页 |
| ·scFv表达文库的构建及文库容量的测定 | 第66页 |
| ·scFv噬菌体表面展示及亲和富集 | 第66-67页 |
| ·特异的phage-scFv ELISA鉴定 | 第67-68页 |
| ·scFv的PCR和酶切验证 | 第68-69页 |
| ·scFv的序列分析 | 第69-73页 |
| ·讨论 | 第73-75页 |
| ·TrxA-bPrP~c融合蛋白突破小鼠免疫耐受产生特异性抗体 | 第73页 |
| ·scFv基因设计和构建 | 第73-74页 |
| ·ScFv噬菌体抗体库的构建 | 第74-75页 |
| ·scFv抗体库的富集筛选及鉴定 | 第75页 |
| ·scFv测序 | 第75页 |
| ·结论 | 第75-77页 |
| 第四章 牛朊蛋白单链抗体及其融合蛋白的特性研究 | 第77-100页 |
| ·前言 | 第77页 |
| ·材料与方法 | 第77-83页 |
| ·菌株与质粒 | 第77-78页 |
| ·培养基 | 第78页 |
| ·试剂与材料 | 第78-79页 |
| ·单链抗体及其融合蛋白表达载体的构建 | 第79-80页 |
| ·大肠杆菌的转化 | 第80-81页 |
| ·融合蛋白的诱导表达 | 第81页 |
| ·融合蛋白的纯化 | 第81页 |
| ·蛋白质的浓度测定 | 第81页 |
| ·单链抗体Z163、Z186和Z1030抗原活性鉴定 | 第81页 |
| ·融合蛋白Z163-L-SBP和Z186-L-SBP的SBP活性的检测 | 第81页 |
| ·融合蛋白Z163-L-SBP和Z186-L-SBP的抗原活性的检测 | 第81-82页 |
| ·融合蛋白Z163-Fc和Z1030-Fc的Fc活性 | 第82页 |
| ·融合蛋白Z163-Fc和Z1030-Fc的抗原活性的检测 | 第82页 |
| ·单链抗体融合蛋白识别bPrP27-30的线性表位 | 第82页 |
| ·通过夹心ELISA筛选抗体配对 | 第82-83页 |
| ·SPR方法测定单链抗体及其融合蛋白的亲和力 | 第83页 |
| ·SPR方法测定与Z186融合后SBP与streptavidin的亲和力 | 第83页 |
| ·结果与分析 | 第83-97页 |
| ·单链抗体Z163、Z186和Z1030表达载体的验证 | 第83-84页 |
| ·单链抗体融合蛋白Z163-L-SBP和Z186-L-SBP表达载体的验证 | 第84-85页 |
| ·单链抗体融合蛋白Z163-Fc和Z1030-Fc表达载体的验证 | 第85页 |
| ·单链抗体及其融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达和纯化 | 第85-86页 |
| ·单链抗体Z163、Z186和Z1030抗牛朊蛋白活性鉴定 | 第86-87页 |
| ·融合蛋白Z163-L-SBP和Z186-L-SBP的SBP活性鉴定 | 第87-88页 |
| ·融合蛋白Z163-L-SBP和Z186-L-SBP抗牛朊蛋白活性鉴定 | 第88页 |
| ·融合蛋白Z163-Fc和Z1030-Fc的Fc活性鉴定 | 第88-89页 |
| ·融合蛋白Z163-Fc和Z1030-Fc的抗牛朊蛋白活性鉴定 | 第89页 |
| ·单链抗体特异识别牛朊蛋白核心区(bPrP27-30)的线性表位 | 第89-92页 |
| ·夹心ELISA筛选单链抗体融合蛋白与单克隆抗体配对和单链抗体融合蛋白配对 | 第92-93页 |
| ·SPR方法测定抗体的亲和力 | 第93-96页 |
| ·SPR方法测定Z186-L-SBP中SBP与streptavidin的亲和力 | 第96-97页 |
| ·讨论 | 第97-98页 |
| ·单链抗体与SBP融合的特点 | 第97页 |
| ·单链抗体与Fc融合的特点 | 第97-98页 |
| ·单链抗体特异识别牛朊蛋白核心区线性表位的应用价值 | 第98页 |
| ·结论 | 第98-100页 |
| 第五章 夹心抗体芯片检测朊蛋白的研究 | 第100-113页 |
| ·前言 | 第100页 |
| ·材料与方法 | 第100-104页 |
| ·实验材料 | 第100页 |
| ·单抗KG9在多聚赖氨酸包被的芯片上的共价固定 | 第100-101页 |
| ·单链抗体融合蛋白scFv-L-SBP的定向固定 | 第101页 |
| ·单链抗体融合蛋白Z163-Fc的Cy3荧光标记和纯化 | 第101页 |
| ·鼠脑组织细胞膜的提取 | 第101页 |
| ·基于单抗和单链抗体融合蛋白的夹心抗体芯片的产生和评价 | 第101-102页 |
| ·基于两种单链抗体融合蛋白的双单链抗体夹心抗体芯片的产生和评价 | 第102-104页 |
| ·结果 | 第104-110页 |
| ·基于单抗和单链抗体融合蛋白的夹心抗体芯片的专一性 | 第104-105页 |
| ·基于单抗和单链抗体融合蛋白的夹心抗体芯片的灵敏度 | 第105-106页 |
| ·基于单抗和单链抗体融合蛋白的夹心抗体芯片检测鼠朊蛋白 | 第106-107页 |
| ·基于双单链抗体融合蛋白夹心抗体芯片的专一性 | 第107-108页 |
| ·基于双单链抗体融合蛋白的夹心抗体芯片的灵敏度 | 第108-109页 |
| ·基于单链抗体融合蛋白的夹心抗体芯片检测鼠朊蛋白 | 第109-110页 |
| ·讨论 | 第110-112页 |
| ·基于单抗和单链抗体融合蛋白的夹心抗体芯片的特点 | 第110-111页 |
| ·基于双单链抗体融合蛋白的夹心抗体芯片的特点 | 第111-112页 |
| ·结论 | 第112-113页 |
| 参考文献 | 第113-126页 |
| 致谢 | 第126-127页 |
| 博士在读期间已发表和待发表论文题录 | 第127页 |
