| 摘 要 | 第1-5页 |
| ABSTRACT | 第5-9页 |
| 一、引言 | 第9-10页 |
| 二、材料与方法 | 第10-20页 |
| (一) 实验材料 | 第10-11页 |
| 1. 实验动物 | 第10页 |
| 2. 实验药品与试剂 | 第10页 |
| 3. 实验器材 | 第10-11页 |
| 4. 仪器设备 | 第11页 |
| (二) 实验方法 | 第11-20页 |
| 1. 实验用血清制备 | 第11-14页 |
| ·兔抗鼠脾白细胞免疫血清制备 | 第11-13页 |
| ·豚鼠血清制备 | 第13-14页 |
| 2. 大鼠心肌细胞条件培养基制备及使用 | 第14页 |
| ·大鼠心肌细胞培养 | 第14页 |
| ·大鼠心肌细胞条件培养基制备 | 第14页 |
| ·利用大鼠心肌细胞条件培养基培养ES细胞 | 第14页 |
| 3. 胎鼠成纤维细胞的分离、培养及饲养层制备 | 第14-15页 |
| ·小鼠胎儿成纤维细胞制备 | 第14-15页 |
| ·饲养层制备 | 第15页 |
| 4. 内细胞团分离、培养 | 第15-18页 |
| ·小鼠胚胎获得 | 第15-16页 |
| ·内细胞团克隆的获得 | 第16-17页 |
| ·内细胞团的增殖及原代克隆培养 | 第17-18页 |
| 5. ES细胞传代培养 | 第18页 |
| ·与饲养层细胞整体进行消化传代 | 第18页 |
| ·利用克隆杯进行单克隆传代 | 第18页 |
| 6. 细胞冷冻和复苏 | 第18-19页 |
| ·冷冻 | 第18页 |
| ·细胞解冻复苏 | 第18-19页 |
| 7. 小鼠ES细胞性质检测 | 第19-20页 |
| ·胚胎干细胞形态鉴定 | 第19页 |
| ·体外分化能力检测 | 第19页 |
| ·碱性磷酸酶染色 | 第19-20页 |
| 三、实验结果 | 第20-27页 |
| (一) 抗血清制备 | 第20页 |
| (二) 大鼠心肌细胞条件培养基制备 | 第20-22页 |
| 1. 培养新生大鼠心肌细胞的形态学变化 | 第20页 |
| 2. 利用大鼠心肌细胞条件培养基培养昆明白小鼠囊胚效果 | 第20-22页 |
| ·滋养层细胞的生长行为 | 第21页 |
| ·内细胞团细胞的生长行为 | 第21页 |
| ·RH-CM培养基对不同阶段胚胎贴壁率、ICM增殖率、ES细胞集落出现的影响 | 第21-22页 |
| (三) 饲养层制备 | 第22-24页 |
| 1. 丝裂霉素抑制成纤维细胞生长作用效果 | 第22-23页 |
| ·丝裂霉素作用与否对成纤维细胞生长抑制效果对比实验 | 第22-23页 |
| ·不同浓度丝裂霉素作用效果 | 第23页 |
| 2. 饲养层的不同制作方法 | 第23页 |
| 3. 饲养层种类 | 第23-24页 |
| (四) 胚胎收集影响 | 第24-25页 |
| 1. 胚胎不同发育阶段的内细胞团增殖情况 | 第24页 |
| 2. 胚胎状态对ES细胞克隆形成率的影响 | 第24-25页 |
| (五) 内细胞团离散方法 | 第25-26页 |
| 1. 消化液作用比较 | 第25页 |
| 2. 消化传代方法 | 第25-26页 |
| 3. 次级传代的集落形态特征及出现的变化情况 | 第26页 |
| (六) 冷冻复苏结果 | 第26页 |
| (七) 类胚胎干细胞特性检测 | 第26-27页 |
| 1. 形态特征 | 第26-27页 |
| 2. 分化结果 | 第27页 |
| 3. 碱性磷酸酶染色实验结果 | 第27页 |
| 四、讨论 | 第27-32页 |
| 五、结论 | 第32-33页 |
| 附录 | 第33-39页 |
| 文献综述 | 第39-62页 |
| (一) 多能性细胞研究的历史与概况 | 第39-46页 |
| 1. 小鼠多能性细胞研究综述 | 第39-43页 |
| ·EC细胞研究的历史 | 第39-40页 |
| ·EG细胞研究的历史 | 第40-41页 |
| ·ES细胞研究的历史 | 第41-43页 |
| 2. 其它物种ES细胞的分离及培养概况 | 第43-45页 |
| ·兔ES细胞 | 第43页 |
| ·水貂ES细胞 | 第43页 |
| ·仓鼠ES细胞 | 第43页 |
| ·牛ES细胞 | 第43-44页 |
| ·羊ES细胞 | 第44页 |
| ·猪ES细胞 | 第44-45页 |
| 3. 灵长类动物和人ES细胞的分离及培养概况 | 第45-46页 |
| (二) ES细胞的生物学特性 | 第46-48页 |
| 1. 全能性及体外增殖性 | 第46-47页 |
| 2. 来源与形态学特征 | 第47页 |
| 3. 分子特征 | 第47-48页 |
| 4. 分化特性 | 第48页 |
| 5. 胚胎发育与ES细胞的分化潜能 | 第48页 |
| (三) 小鼠ES细胞增殖及未分化机理的研究 | 第48-50页 |
| 1. LIF因子 | 第48-49页 |
| 2. Oct-4基因 | 第49-50页 |
| (四) ES细胞培养的研究 | 第50-53页 |
| 1. 培养液的组成 | 第50-51页 |
| 2. 分化抑制作用 | 第51-53页 |
| ·饲养层 | 第51-52页 |
| ·条件培养基 | 第52-53页 |
| ·细胞因子 | 第53页 |
| (五) ES细胞建系方法 | 第53-55页 |
| 1. 培养体系 | 第53页 |
| ·有饲养层培养体系 | 第53页 |
| ·无饲养层培养体系 | 第53页 |
| 2. 胚胎采集 | 第53-54页 |
| 3. ICM的获取 | 第54-55页 |
| ·直接分离法 | 第54页 |
| ·免疫分离法 | 第54页 |
| ·热休克法 | 第54页 |
| ·延迟着床法 | 第54-55页 |
| ·ES细胞组织块培养 | 第55页 |
| ·饲养层倒置培养 | 第55页 |
| 4. ES细胞的传代培养 | 第55页 |
| (六) ES细胞生物学特性的检测 | 第55-58页 |
| 1. 形态鉴定 | 第56页 |
| 2. 碱性磷酸酶(AKP)活性的检测 | 第56页 |
| 3. 染色体数目与结构 | 第56页 |
| 4. 体外分化实验 | 第56-57页 |
| ·自然分化 | 第57页 |
| ·诱导分化 | 第57页 |
| 5. 体内分化实验 | 第57页 |
| 6. 嵌合体实验 | 第57-58页 |
| 7. 核移植 | 第58页 |
| (七) ES应用潜力 | 第58-60页 |
| 1. 胚胎干细胞是动物克隆的高效材料 | 第58页 |
| 2. 胚胎干细胞是进行细胞分化和发育生物学研究的重要材料 | 第58-59页 |
| 3. 以ES细胞技术生产转基因动物 | 第59页 |
| 4. 干细胞治疗与医学革命 | 第59-60页 |
| (八) ES细胞研究存在的问题 | 第60-62页 |
| 1. ES细胞系的分离效率低 | 第60-61页 |
| 2. ES细胞定向分化的理论与技术水平低 | 第61-62页 |
| 图表 | 第62-71页 |
| 参考文献 | 第71-75页 |
| 致谢 | 第75-76页 |
| 发表学术论文目录 | 第76页 |
