| 摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-9页 |
| 缩略语表 | 第9-11页 |
| 目录 | 第11-16页 |
| 第一部分 紫杉二烯合成酶基因克隆及其转化赤霉菌的研究 | 第16-83页 |
| 1 文献综述 | 第16-30页 |
| ·紫杉醇的发现及其抗癌作用机理的研究 | 第16-18页 |
| ·紫杉醇的发现 | 第16-17页 |
| ·紫杉醇的抗癌作用机理 | 第17页 |
| ·紫杉醇的临床应用 | 第17-18页 |
| ·紫杉醇工业生产与药源供给现状 | 第18-25页 |
| ·从栽培品种中提取紫杉醇 | 第20页 |
| ·从红豆杉近缘科属植物中筛选含紫杉醇的植物 | 第20页 |
| ·化学全合成紫杉醇 | 第20-21页 |
| ·生物/化学半合成生产紫杉醇 | 第21页 |
| ·红豆杉内生真菌发酵 | 第21-22页 |
| ·利用植物细胞培养技术生产紫杉醇 | 第22-25页 |
| ·紫杉醇生物合成的研究 | 第25-27页 |
| ·紫杉醇的生物合成途径 | 第25页 |
| ·参与紫杉醇生物合成的代谢酶类 | 第25-27页 |
| ·本实验研究背景、目的及意义 | 第27-30页 |
| ·目的基因的选择依据 | 第27-28页 |
| ·以赤霉菌作为目的基因表达受体的目的及意义 | 第28-30页 |
| 2 材料和方法 | 第30-47页 |
| ·菌株和质粒 | 第30-31页 |
| ·试剂 | 第31页 |
| ·方法 | 第31-47页 |
| ·引物设计 | 第31页 |
| ·紫杉二烯合成酶基因全长cDNA克隆 | 第31-36页 |
| ·ts-cDNA丝状真菌表达载体构建 | 第36页 |
| ·cps基因片断克隆及cps基因打靶载体构建 | 第36-39页 |
| ·赤霉菌原生质体制备 | 第39-41页 |
| ·赤霉菌转化 | 第41-43页 |
| ·赤霉菌转化子的鉴定 | 第43-47页 |
| 3 结果与分析 | 第47-74页 |
| ·紫杉二烯合成酶基因cDNA克隆 | 第47-55页 |
| ·红豆杉愈伤组织细胞系总RNA RT-PCR结果 | 第47页 |
| ·紫杉二烯合成酶cDNA在大肠杆菌BL21s中的表达 | 第47-50页 |
| ·ts-cDNA与pET15b重组质粒的酶切检测 | 第50-52页 |
| ·ts-cDNA序列测定 | 第52-55页 |
| ·ts-cDNA丝状真菌表达载体构建 | 第55-58页 |
| ·ts-cDNA与pAN52-1Not重组 | 第55-57页 |
| ·pANts5与潮霉素B抗性表达框重组 | 第57-58页 |
| ·cps基因片断克隆及cps基因打靶载体构建 | 第58-63页 |
| ·赤霉菌菌株赤霉素的合成 | 第58-59页 |
| ·赤霉菌基因组DNA提取及cps基因片断的克隆化 | 第59-62页 |
| ·cps基因打靶载体构建 | 第62-63页 |
| ·赤霉菌原生质体制备 | 第63-68页 |
| ·破壁酶种类对赤霉菌原生质体产量的影响 | 第63-64页 |
| ·pH值对赤霉菌原生质体产量的影响 | 第64-65页 |
| ·酶解温度对赤霉菌原生质体产量的影响 | 第65页 |
| ·破壁酶浓度对赤霉菌原生质体产量的影响 | 第65-66页 |
| ·酶解时间对赤霉菌原生质体产量及再生率的影响 | 第66页 |
| ·菌龄对赤霉菌原生质体产量及再生率的影响 | 第66-67页 |
| ·再生培养基对赤霉菌原生质体再生率的影响 | 第67-68页 |
| ·赤霉菌原生质体再生观察 | 第68页 |
| ·赤霉菌转化 | 第68-71页 |
| ·赤霉菌菌株潮霉素敏感性测定 | 第68-70页 |
| ·电穿孔法转化赤霉菌原生质体 | 第70页 |
| ·基因枪法转化赤霉菌菌丝断片 | 第70页 |
| ·原生质体/PEG法转化赤霉菌 | 第70-71页 |
| ·赤霉菌转化子的鉴定 | 第71-74页 |
| ·赤霉菌转化子的形态鉴定 | 第71-72页 |
| ·赤霉菌转化子的分子生物学鉴定 | 第72-74页 |
| 4 讨论 | 第74-80页 |
| ·紫杉醇的药源开发 | 第74-75页 |
| ·基因克隆材料的选择 | 第75-76页 |
| ·赤霉菌菌种差异对转化效率的影响 | 第76-77页 |
| ·赤霉菌低转化效率的形成因素 | 第77-79页 |
| ·转化方法对转化效率的影响 | 第79-80页 |
| 5 结论 | 第80-81页 |
| 6 本研究创新点 | 第81-82页 |
| 7 本研究有待进一步开展的工作 | 第82-83页 |
| 第二部分 肿瘤血管生成抑制因子Arresten基因克隆及其对烟草的转化 | 第83-115页 |
| 1 抗肿瘤药物的研究现状 | 第83-86页 |
| ·正在研发的新型抗肿瘤药物 | 第84页 |
| ·肿瘤新生血管生成抑制剂 | 第84-85页 |
| ·血管生成抑制理论的提出 | 第84-85页 |
| ·肿瘤血管生成抑制剂的研发概况 | 第85页 |
| ·本研究的目的意义 | 第85-86页 |
| 2 材料和方法 | 第86-95页 |
| ·菌株、质粒和材料 | 第86页 |
| ·试剂 | 第86页 |
| ·方法 | 第86-95页 |
| ·Arresten基因全长cDNA克隆 | 第86-89页 |
| ·RT-PCR法扩增Arresten基因全长cDNA | 第86-88页 |
| ·arresten-cDNA在pMD18-T vector中的克隆化 | 第88-89页 |
| ·arresten-cDNA植物表达载体构建 | 第89-91页 |
| ·arresten-cDNA回收及其与pCAMBIA1301的重组 | 第89页 |
| ·pCAMBIAarr转化根癌农杆菌LBA4404 | 第89-91页 |
| ·烟草一步成苗再生体系的建立 | 第91-92页 |
| ·烟草无菌苗的培养 | 第91页 |
| ·秦烟95叶片外植体不定芽的诱导 | 第91页 |
| ·秦烟95对潮霉素B的敏感性测定 | 第91-92页 |
| ·根癌农杆菌LBA4404(pCAMBIAarr)转化烟草秦烟95 | 第92-93页 |
| ·根癌农杆菌LBA4404(pCAMBIAarr)的培养 | 第92页 |
| ·农杆菌感染 | 第92页 |
| ·烟草转化材料的培养及筛选 | 第92页 |
| ·烟草转基因苗的培养 | 第92页 |
| ·烟草转基因苗的炼苗移栽 | 第92-93页 |
| ·转基因烟草的鉴定 | 第93-95页 |
| ·烟草基因组DNA的提取 | 第93页 |
| ·转基因烟草的PCR检测 | 第93页 |
| ·转基因烟草的Southern杂交检测 | 第93页 |
| ·转基因烟草的RT-PCR检测 | 第93-95页 |
| 3 结果与分析 | 第95-107页 |
| ·全长arresten-cDNA克隆 | 第95-98页 |
| ·人胎盘组织总RNA提取 | 第95页 |
| ·RT-PCR法克隆arresten-cDNA | 第95-96页 |
| ·arresten-cDNA在T-vector中的克隆化 | 第96-97页 |
| ·arresten-cDNA序列测定 | 第97-98页 |
| ·arresten-cDNA植物表达载体构建 | 第98页 |
| ·arrseten-cDNA植物表达载体构建流程 | 第98页 |
| ·arrseten-cDNA与pCAMBIA1301重组质粒鉴定 | 第98页 |
| ·pCAMBIAarr转化根癌农杆菌LBA4404 | 第98-101页 |
| ·烟草一步成苗再生体系的建立 | 第101-103页 |
| ·烟草无菌苗培养及叶片诱导再生植株 | 第101-102页 |
| ·秦烟95对潮霉素B的敏感性 | 第102-103页 |
| ·根癌农杆菌LBA4404(pCAMBIAarr)转化烟草秦烟95 | 第103-105页 |
| ·转化子的筛选与植株再生 | 第103-104页 |
| ·浸染时间对转化效率的影响 | 第104-105页 |
| ·烟草转基因苗的培养与移栽 | 第105页 |
| ·烟草转基因苗的检测 | 第105-107页 |
| ·PCR法检测转基因烟草中目的基因的整合 | 第105-106页 |
| ·Southen blot杂交检测转基因植株 | 第106-107页 |
| ·RT-PCR检测转基因植株中目的基因转录水平上的表达 | 第107页 |
| 4 讨论 | 第107-113页 |
| ·关于Arresten表达受体的选择 | 第107-109页 |
| ·利用转基因植物生产药用蛋白的可操作性 | 第109-111页 |
| ·烟草作为药用蛋白表达受体的优越性 | 第111-112页 |
| ·烟草作为药用蛋白生产系统亟待解决的问题 | 第112-113页 |
| 5 结论 | 第113-114页 |
| 6 本研究创新点 | 第114页 |
| 7 本研究有待进一步开展的工作 | 第114-115页 |
| 参考文献 | 第115-131页 |
| 攻读博士学位期间研究成果和奖励 | 第131-132页 |
| 致谢 | 第132页 |
