| 缩写表 | 第1-2页 |
| 摘要 | 第2-3页 |
| ABSTRACT | 第3-18页 |
| 文献综述 | 第18-44页 |
| 1 紫杉醇研究背景及现状 | 第18-25页 |
| ·红豆杉及紫杉醇概况 | 第18页 |
| ·紫杉醇作用机理 | 第18-19页 |
| ·紫杉醇研究现状 | 第19-25页 |
| ·化学合成 | 第19页 |
| ·人工栽培 | 第19-20页 |
| ·真菌生产 | 第20页 |
| ·植物细胞培养法 | 第20-25页 |
| ·利用红豆杉发根培养生产紫杉醇 | 第25页 |
| 2 紫杉醇代谢的分子生物学研究 | 第25-31页 |
| ·紫杉醇的生物合成 | 第25-26页 |
| ·紫杉醇生物合成途径及关键酶的分子生物学研究 | 第26-31页 |
| ·紫杉醇骨架生物合成及其相关酶 | 第26-29页 |
| ·紫杉醇C-13侧链生物合成中相关酶 | 第29-31页 |
| 3 植物转基因方法概述 | 第31-41页 |
| ·载体转化系统 | 第32-36页 |
| ·根癌农杆菌Ti质粒介导的基因转化 | 第32-34页 |
| ·发根农杆菌Ri质粒载体基因转化 | 第34-35页 |
| ·植物病毒载体介导基因转化 | 第35-36页 |
| ·种质转化系统 | 第36-38页 |
| ·花粉管导入法 | 第36-37页 |
| ·生殖细胞浸泡法 | 第37页 |
| ·胚囊、子房注射法 | 第37-38页 |
| ·直接转化系统 | 第38-40页 |
| ·化学诱导DNA直接转化 | 第38-39页 |
| ·物理诱导DNA直接转化 | 第39-40页 |
| ·植物基因转化系统的选择策略 | 第40-41页 |
| ·基因转化系统的评价条件 | 第40-41页 |
| ·植物基因转化系统的选择原则 | 第41页 |
| 4 根癌农杆菌介导的红豆杉遗传转化 | 第41-42页 |
| 5 结束语 | 第42页 |
| 6 本课题的研究意义及技术路线 | 第42-44页 |
| 第一章 红豆杉细胞生长体系优化及紫杉醇代谢限速步骤的研究 | 第44-54页 |
| 材料和方法 | 第44-46页 |
| 1 实验材料及培养基 | 第44页 |
| 2 红豆杉细胞生长条件的优化 | 第44-45页 |
| ·激素组合的优化 | 第44-45页 |
| ·继代时间的优化 | 第45页 |
| ·培养基主要营养成分测定 | 第45页 |
| 3 红豆杉细胞紫杉醇及bacⅢ代谢调节的探讨 | 第45页 |
| ·液体培养细胞系的建立 | 第45页 |
| ·紫杉醇及bacⅢ代谢特征 | 第45页 |
| ·C-13侧链前体Phe添加对紫杉烷代谢的影响 | 第45页 |
| 4 实验参数的测定 | 第45-46页 |
| ·生长参数 | 第45-46页 |
| ·培养基中紫杉烷的提取及测定 | 第46页 |
| 结果与分析 | 第46-51页 |
| 1 细胞生长条件的优化 | 第46-50页 |
| ·最佳激素组合的筛选 | 第46-47页 |
| ·细胞生长大周期 | 第47页 |
| ·继代时期的优化 | 第47-48页 |
| ·主要培养基成分的吸收 | 第48-50页 |
| 2 南方红豆杉细胞紫杉醇及bacⅢ代谢调节的探讨 | 第50-51页 |
| ·紫杉醇和bacⅢ的代谢特征 | 第50页 |
| ·添加C-13侧链前体Phe对紫杉醇及bacⅢ代谢的影响 | 第50-51页 |
| 讨论 | 第51-54页 |
| 1 细胞生长条件的优化 | 第51-52页 |
| ·培养基激素组合的优化 | 第51页 |
| ·继代时间的优化 | 第51-52页 |
| ·细胞营养吸收动力学的研究 | 第52页 |
| 2 南方红豆杉细胞紫杉醇及bacⅢ代谢调节 | 第52-54页 |
| 第二章 转BAPT基因红豆杉细胞次生代谢的研究 | 第54-99页 |
| 第一节 南方红豆杉细胞苯丙基转移酶基因的克隆及序列分析 | 第54-64页 |
| 材料与方法 | 第54-60页 |
| 1 材料 | 第54-56页 |
| ·植物材料 | 第54页 |
| ·菌种及质粒 | 第54页 |
| ·各种酶及试剂盒 | 第54-55页 |
| ·主要化学试剂及溶液配制 | 第55-56页 |
| 2 方法 | 第56-60页 |
| ·材料处理 | 第56页 |
| ·南方红豆杉细胞总RNA的提取与鉴定 | 第56页 |
| ·总RNA的提取 | 第56页 |
| ·总RNA的鉴定 | 第56页 |
| ·反转录与聚合酶链式反应(RT-PCR) | 第56-57页 |
| ·外源基因与载体的连接反应 | 第57-58页 |
| ·特异DNA条带的回收 | 第57-58页 |
| ·连接反应 | 第58页 |
| ·感受态细胞的制备(CaCl_2法) | 第58页 |
| ·对E.coli DH5α转化 | 第58-59页 |
| ·质粒DNA的提取 | 第59页 |
| ·重组质粒的酶切鉴定 | 第59页 |
| ·测序及同源性比较 | 第59-60页 |
| 结果与分析 | 第60-63页 |
| 1 植物材料总RNA的检测结果 | 第60页 |
| 2 反转录偶联聚合酶链式反应(RT-PCR) | 第60页 |
| 3 重组质粒鉴定 | 第60-61页 |
| ·质粒的提取 | 第60-61页 |
| ·重组质粒的酶切鉴定 | 第61页 |
| 4 苯丙基转移酶cDNA序列分析结果 | 第61-63页 |
| 讨论 | 第63-64页 |
| 第二节 融合蛋白在大肠杆菌中的表达、分离纯化及抗体制备 | 第64-77页 |
| 材料和方法 | 第64-68页 |
| 1 材料 | 第64页 |
| ·动物材料 | 第64页 |
| ·菌株及质粒载体 | 第64页 |
| ·PCR引物 | 第64页 |
| ·工具酶及主要试剂 | 第64页 |
| 2 方法 | 第64-68页 |
| ·pET-BAPT原核表达载体的构建及鉴定 | 第64-65页 |
| ·重组蛋白的诱导表达及鉴定 | 第65-66页 |
| ·重组蛋白的诱导表达 | 第65页 |
| ·重组蛋白在大肠杆菌细胞中的分布 | 第65-66页 |
| ·重组BAPT蛋白纯化 | 第66页 |
| ·抗血清的制备 | 第66-68页 |
| ·SDS-PAGE电泳 | 第66-67页 |
| ·SDS-PAGE方法回收蛋白 | 第67页 |
| ·抗血清的制备 | 第67页 |
| ·抗血清效价测定(间接ELISA) | 第67页 |
| ·抗血清特异性检测(Western blot) | 第67-68页 |
| 结果与分析 | 第68-76页 |
| 1 pET-BAPT原核表达载体的构建与鉴定 | 第68-72页 |
| 2 pET-BAPT融合蛋白的诱导表达、纯化与鉴定 | 第72-74页 |
| 3 BAPT融合蛋白抗血清的制备 | 第74-76页 |
| ·SDS-PAGE方法回收蛋白 | 第74-75页 |
| ·抗血清制备与效价的测定 | 第75页 |
| ·抗血清特异性检测 | 第75-76页 |
| 讨论 | 第76-77页 |
| 第三节 转BAPT基因南方红豆杉细胞代谢机理的探讨 | 第77-99页 |
| 材料和方法 | 第77-85页 |
| 1 材料 | 第77页 |
| ·植物材料 | 第77页 |
| ·菌种及质粒 | 第77页 |
| ·工具酶及主要试剂 | 第77页 |
| 2 方法 | 第77-85页 |
| ·克隆载体和双元载体pBI-BAPT的构建与鉴定 | 第77-78页 |
| ·pBI121-BAPT对农杆菌的转化 | 第78-79页 |
| ·农杆菌感受态的制备 | 第78页 |
| ·重组质粒对农杆菌的转化 | 第78页 |
| ·回复动员法鉴定农杆菌 | 第78-79页 |
| ·转基因红豆杉细胞的制备 | 第79页 |
| ·红豆杉细胞悬浮系的建立 | 第79页 |
| ·细胞对抗生素的敏感性实验 | 第79页 |
| ·农杆菌的准备 | 第79页 |
| ·侵染和共培养 | 第79页 |
| ·抗性细胞的筛选 | 第79页 |
| ·转基因红豆杉细胞的鉴定 | 第79-84页 |
| ·GUS细胞染色 | 第79-80页 |
| ·PCR-Southern及Southern-blot | 第80-84页 |
| ·Western blot分析 | 第84页 |
| ·转基因红豆杉细胞紫杉醇含量测定 | 第84-85页 |
| 结果与分析 | 第85-95页 |
| 1 双元载体的构建及农杆菌转化 | 第85-87页 |
| ·双元载体pBI-BAPT，pBI-BAPT-GUS的构建与鉴定 | 第85-87页 |
| ·双元载体转化农杆菌菌株GV3101 | 第87页 |
| 2 转BAPT基因红豆杉细胞的制备和鉴定 | 第87-95页 |
| ·红豆杉悬浮培养体系的建立 | 第87-88页 |
| ·细胞对抗生素的敏感性实验 | 第88-89页 |
| ·转BAPT基因红豆杉细胞的鉴定 | 第89-93页 |
| ·报告基因表达活性鉴定 | 第89-90页 |
| ·转基因红豆杉细胞Kan抗性筛选 | 第90页 |
| ·转基因红豆杉细胞的PCR鉴定 | 第90-91页 |
| ·PCR-Southern鉴定 | 第91-92页 |
| ·Southern-blot鉴定 | 第92-93页 |
| ·转基因红豆杉细胞bacⅢ和紫杉醇含量分析 | 第93-94页 |
| ·红豆杉细胞超表达BAPT的Western blot检测 | 第94-95页 |
| 讨论 | 第95-99页 |
| 1 双元载体的构建及农杆菌的转化 | 第95页 |
| 2 红豆杉细胞的遗传转化 | 第95-97页 |
| 3 转基因红豆杉细胞的鉴定 | 第97页 |
| 4 BAPT在紫杉醇次生代谢中的作用 | 第97-99页 |
| 结论 | 第99-100页 |
| 参考文献 | 第100-110页 |
| 个人简历 | 第110-111页 |
| 致谢 | 第111-112页 |
