| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-9页 |
| 中英文对照和缩略词表 | 第15-16页 |
| 第一章 绪论 | 第16-34页 |
| 1.1 引言 | 第16-17页 |
| 1.2 抗菌肽的研究现状及进展 | 第17-21页 |
| 1.3 天蚕素A抗菌肽概述 | 第21-23页 |
| 1.4 大肠杆菌外源重组蛋白概述 | 第23-28页 |
| 1.5 载体构建功能性元件概述 | 第28-30页 |
| 1.5.1 淀粉样蛋白Sup35NM | 第28-29页 |
| 1.5.2 自剪切短肽Mxe GyrA和自剪切短肽ELK16 | 第29-30页 |
| 1.6 本课题的目的意义和主要研究内容 | 第30-34页 |
| 1.6.1 目的意义 | 第30-31页 |
| 1.6.2 主要研究内容 | 第31-33页 |
| 1.6.3 技术路线 | 第33-34页 |
| 第二章 大肠杆菌胞内高效表达天蚕素A抗菌肽表达体系的构建及其活性表征 | 第34-63页 |
| 2.1 引言 | 第34-35页 |
| 2.2 材料与方法 | 第35-50页 |
| 2.2.1 材料 | 第35-36页 |
| 2.2.2 仪器 | 第36页 |
| 2.2.3 试剂 | 第36-39页 |
| 2.2.4 重组融合表达载体的构建 | 第39-44页 |
| 2.2.5 重组表达菌的构建 | 第44页 |
| 2.2.6 GFP-Mxe-His和GFP-Mxe-ELK16在BL21(DE3)中的表达及荧光观察 | 第44-45页 |
| 2.2.7 重组表达菌pET21-CMH-BL21(DE3)的小量表达检测及条件优化 | 第45-46页 |
| 2.2.8 重组表达菌pET30-CME-BL21(DE3)的小量表达检测及条件优化 | 第46-47页 |
| 2.2.9 融合蛋白CeA-Mxe-His的大量表达及纯化 | 第47页 |
| 2.2.10 融合蛋白CeA-Mxe-His的切割处理及天蚕素A抗菌肽的收集 | 第47-48页 |
| 2.2.11 融合蛋白CeA-Mxe-ELK16的大量表达 | 第48页 |
| 2.2.12 融合蛋白CeA-Mxe-ELK16的切割处理及天蚕素A抗菌肽的收集 | 第48-49页 |
| 2.2.13 天蚕素A抗菌肽的抗菌活性表征 | 第49-50页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第50-61页 |
| 2.3.1 重组融合表达载体的构建 | 第50-51页 |
| 2.3.2 融合蛋白CeA-Mxe-His在BL21(DE3)中的小量表达检测及条件优化 | 第51-54页 |
| 2.3.3 融合蛋白CeA-Mxe-His在BL21(DE3)中的大量表达及纯化 | 第54-55页 |
| 2.3.4 融合蛋白CeA-Mxe-His的切割优化及天蚕素A抗菌肽的收集 | 第55-56页 |
| 2.3.5 融合蛋白GFP-Mxe-His和GFP-Mxe-ELK16在BL21(DE3)中的荧光观察.. | 第56-57页 |
| 2.3.6 融合蛋白CeA-Mxe-ELK16在BL21(DE3)中的小量表达检测及条件优化 | 第57-58页 |
| 2.3.7 融合蛋白CeA-Mxe-ELK16的大量表达及切割条件优化 | 第58-59页 |
| 2.3.8 乙酸处理获得高纯度的天蚕素A抗菌肽 | 第59-60页 |
| 2.3.9 天蚕素A抗菌肽的抗菌活性表征 | 第60-61页 |
| 2.4 本章小结 | 第61-63页 |
| 第三章 大肠杆菌无细胞表达系统实现天蚕素A抗菌肽表达体系的建立及活性表征 | 第63-84页 |
| 3.1 引言 | 第63页 |
| 3.2 材料与方法 | 第63-73页 |
| 3.2.1 菌株与质粒 | 第63-64页 |
| 3.2.2 主要仪器设备 | 第64-65页 |
| 3.2.3 主要试剂 | 第65页 |
| 3.2.4 主要培养基 | 第65页 |
| 3.2.5 主要溶液与缓冲液 | 第65-68页 |
| 3.2.6 T7RNA聚合酶的制备 | 第68-69页 |
| 3.2.7 大肠杆菌A19菌株生长曲线的测定 | 第69页 |
| 3.2.8 大肠杆菌S30抽提物的制备 | 第69-70页 |
| 3.2.9 大肠杆菌S30抽提物破碎压力条件优化 | 第70页 |
| 3.2.10 重组表达载体的构建 | 第70-71页 |
| 3.2.11 无细胞表达体系的构建 | 第71-73页 |
| 3.2.12 天蚕素A抗菌肽的纯化 | 第73页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第73-83页 |
| 3.3.1 T7RNA聚合酶的表达及纯化 | 第73-74页 |
| 3.3.2 重组表达载体的构建 | 第74-76页 |
| 3.3.3 绿色荧光蛋白在无细胞体系中的表达及荧光定量 | 第76-77页 |
| 3.3.4 不同破碎压力对大肠杆菌S30抽提物活性的影响 | 第77-78页 |
| 3.3.5 天蚕素A抗菌肽在无细胞体系中的表达及纯化 | 第78-79页 |
| 3.3.6 天蚕素A抗菌肽的抑菌性能表征 | 第79-80页 |
| 3.3.7 三种表达体系产天蚕素A抗菌肽的成本及效率比较 | 第80-83页 |
| 3.4 本章小结 | 第83-84页 |
| 第四章 基于大肠杆菌Csg系统实现天蚕素A抗菌肽表面展示系统的建立及活性表征. | 第84-111页 |
| 4.1 引言 | 第84页 |
| 4.2 材料与方法 | 第84-96页 |
| 4.2.1 菌株和质粒 | 第84-85页 |
| 4.2.2 基因片段 | 第85页 |
| 4.2.3 主要仪器设备 | 第85页 |
| 4.2.4 主要试剂 | 第85-86页 |
| 4.2.5 主要培养基 | 第86页 |
| 4.2.6 抗体 | 第86页 |
| 4.2.7 主要抗生素及诱导剂 | 第86-87页 |
| 4.2.8 主要溶液与缓冲液 | 第87页 |
| 4.2.9 SDD-AGE凝胶电泳 | 第87-88页 |
| 4.2.10 透射电子显微镜观察 | 第88-89页 |
| 4.2.11 荧光共聚焦显微镜观察 | 第89页 |
| 4.2.12 刚果红实验 | 第89页 |
| 4.2.13 大肠杆菌BL21(DE3)基因组csgBAC基因的敲除 | 第89-92页 |
| 4.2.14 重组表达质的构建 | 第92-93页 |
| 4.2.15 跨膜蛋白CsgG的表达优化及荧光显微镜观察 | 第93-94页 |
| 4.2.16 红色荧光蛋白RFP基于大肠杆菌Csg系统的表面展示 | 第94-96页 |
| 4.2.17 天蚕素A融合蛋白基于Csg系统的表达及表面展示 | 第96页 |
| 4.2.18 诱导切割处理及天蚕素A抗菌肽的收集 | 第96页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第96-110页 |
| 4.3.1 敲除大肠杆菌csgBAC基因同源臂的制备 | 第96-97页 |
| 4.3.2 突变株BL21(DE3)?csgBAC的筛选及鉴定 | 第97-98页 |
| 4.3.3 突变株BL21(DE3)?csgBAC的表型表征 | 第98-100页 |
| 4.3.4 重组载体pKJE7-CsgG-GFP和pKJE7-CsgG-HIS的构建 | 第100-101页 |
| 4.3.5 重组分泌表达载体的构建 | 第101-102页 |
| 4.3.6 跨膜蛋白csgG的表达及膜定位检测 | 第102-103页 |
| 4.3.7 红色荧光蛋白RFP基于Csg系统的表达及表面展示 | 第103-106页 |
| 4.3.8 天蚕素A抗菌肽基于Csg系统的表达及表面展示 | 第106-107页 |
| 4.3.9 融合蛋白的切割处理及天蚕素A抗菌肽的收集 | 第107-108页 |
| 4.3.10 天蚕素A抗菌肽的抗菌活性表征 | 第108-110页 |
| 4.4 本章小结 | 第110-111页 |
| 第五章 高抗菌性能天蚕素A突变体的设计、表达及其功能研究 | 第111-130页 |
| 5.1 引言 | 第111页 |
| 5.2 材料与方法 | 第111-117页 |
| 5.2.1 材料 | 第111-112页 |
| 5.2.2 相关分析软件 | 第112页 |
| 5.2.3 试剂 | 第112-113页 |
| 5.2.4 抗菌肽的理化性质分析 | 第113页 |
| 5.2.5 抗菌肽二级结构模拟分析 | 第113页 |
| 5.2.6 突变体肽的设计 | 第113页 |
| 5.2.7 定点突变技术 | 第113-114页 |
| 5.2.8 突变体重组表达载体的构建 | 第114页 |
| 5.2.9 重组表达载体pET30-MME的构建 | 第114页 |
| 5.2.10 重组表达菌pET21-CME-BL21(DE3)的构建 | 第114页 |
| 5.2.11 融合蛋白PEW300-Mxe-ELK16的小量表达及条件优化 | 第114页 |
| 5.2.12 融合蛋白PEW300-Mxe-ELK16的切割及其条件优化 | 第114-115页 |
| 5.2.13 乙酸处理及突变体肽PEW300的收集 | 第115页 |
| 5.2.14 天蚕素A抗菌肽与突变体肽PEW300的抗菌性能表征 | 第115页 |
| 5.2.15 抑菌圈测定实验 | 第115页 |
| 5.2.16 突变体肽PEW300对绿脓杆菌的抑菌动力学测定 | 第115-116页 |
| 5.2.17 突变体肽PEW300温度、pH、血清及蛋白酶稳定性测定 | 第116页 |
| 5.2.18 突变体肽PEW300溶血性测定 | 第116-117页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第117-129页 |
| 5.3.1 突变体的构建及其理化性质分析 | 第117-118页 |
| 5.3.2 高抑菌性能突变体的筛选 | 第118-119页 |
| 5.3.3 突变体肽PEW300的设计及其理化性质分析 | 第119-120页 |
| 5.3.4 突变体肽PEW300的二级结构分析 | 第120-121页 |
| 5.3.5 重组载体pET30-MME的构建 | 第121页 |
| 5.3.6 融合蛋白PEW300-Mxe-ELK16的小量表达及条件优化 | 第121-122页 |
| 5.3.7 融合蛋白PEW300-Mxe-ELK16的切割处理及条件优化 | 第122-123页 |
| 5.3.8 乙酸处理及突变体肽PEW300的收集 | 第123-124页 |
| 5.3.9 天蚕素A及PEW300抗菌肽的抗菌性能表征 | 第124-126页 |
| 5.3.10 PEW300抗菌肽对绿脓杆菌抑菌动力学的测定 | 第126-127页 |
| 5.3.11 PEW300抗菌肽的稳定性检测 | 第127-128页 |
| 5.3.12 PEW300抗菌肽的溶血特性检测 | 第128-129页 |
| 5.4 本章小结 | 第129-130页 |
| 结论与展望 | 第130-134页 |
| 结论 | 第130-132页 |
| 展望 | 第132-134页 |
| 参考文献 | 第134-152页 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 | 第152-155页 |
| 致谢 | 第155-157页 |
| 附件 | 第157页 |
