| 摘要 | 第4-8页 |
| Abstract | 第8-13页 |
| 英文缩略语 | 第14-20页 |
| 1 前言 | 第20-22页 |
| 第一部分：肺孢子菌p55多表位串联基因重组腺病毒载体疫苗构建及真核细胞内表达验证 | 第22-36页 |
| 2 实验材料与仪器 | 第22-26页 |
| 2.1 基因、质粒、菌株、细胞株 | 第22页 |
| 2.2 主要试剂 | 第22-23页 |
| 2.3 主要仪器 | 第23-24页 |
| 2.4 试剂配制 | 第24-26页 |
| 3 实验方法 | 第26-31页 |
| 3.1 p55多表位串联基因的获取 | 第26-27页 |
| 3.1.1 p55多表位串联基因的提取 | 第26-27页 |
| 3.1.2 p55多表位串联基因的扩增 | 第27页 |
| 3.2 重组腺病毒载体的构建 | 第27-28页 |
| 3.2.1 腺病毒连接质粒线性化 | 第27-28页 |
| 3.2.2 腺病毒连接质粒与p55TAG目的基因片段连接 | 第28页 |
| 3.3 重组腺病毒载体的转化、筛选和鉴定 | 第28-29页 |
| 3.3.1 重组腺病毒载体转化 | 第28-29页 |
| 3.3.2 转化产物筛选、鉴定 | 第29页 |
| 3.4 包装重组腺病毒 | 第29-30页 |
| 3.4.1 HKE293细胞的复苏、培养 | 第29页 |
| 3.4.2 重组腺病毒载体转染及病毒包装 | 第29-30页 |
| 3.4.3 包装腺病毒的收集 | 第30页 |
| 3.5 重组腺病毒鉴定 | 第30-31页 |
| 3.5.1 重组腺病毒液p55TAG目的基因片段PCR验证 | 第30页 |
| 3.5.2 Western blot检测重组腺病毒目的蛋白表达 | 第30-31页 |
| 4 实验结果 | 第31-36页 |
| 4.1 p55多表位串联基因PCR扩增结果 | 第31-32页 |
| 4.2 重组腺病毒载体筛选鉴定结果 | 第32-33页 |
| 4.3 重组腺病毒载体转染HEK293细胞病毒包装结果 | 第33页 |
| 4.4 包装重组腺病毒中p55TAG目的基因PCR鉴定结果 | 第33-34页 |
| 4.5 重组腺病毒在HEK293细胞中p55TAG目的基因蛋白表达结果 | 第34-36页 |
| 第二部分: 肺孢子菌p55多表位串联基因重组腺病毒载体疫苗免疫原性检验 | 第36-62页 |
| 5 实验材料与仪器 | 第36-39页 |
| 5.1 病毒、细胞株、实验动物 | 第36页 |
| 5.2 主要试剂 | 第36-37页 |
| 5.3 主要仪器 | 第37页 |
| 5.4 试剂配制 | 第37-39页 |
| 6 实验方法 | 第39-47页 |
| 6.1 重组腺病毒的扩增、纯化、滴度测定 | 第39-41页 |
| 6.1.1 重组腺病毒的扩增 | 第39页 |
| 6.1.2 重组腺病毒的纯化 | 第39-40页 |
| 6.1.3 重组腺病毒的滴度测定(TCID50法) | 第40-41页 |
| 6.2 重组腺病毒免疫动物及样本采集 | 第41-42页 |
| 6.2.1 动物免疫方案 | 第41页 |
| 6.2.2 免疫后样本采集方案、方法 | 第41-42页 |
| 6.3 重组腺病毒免疫原性检验 | 第42-47页 |
| 6.3.1 鼠血清中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-17四种细胞因子水平检测 | 第42-43页 |
| 6.3.2 鼠脾细胞中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-17四种细胞因子Real-time PCR相对定量检测 | 第43-45页 |
| 6.3.3 鼠血清中总IgG抗体及IgG1和IgG2a抗体亚类水平ELISA法检测 | 第45-47页 |
| 6.3.4 鼠脾T淋巴细胞亚群流式细胞术检测 | 第47页 |
| 6.4 统计学分析 | 第47页 |
| 7 实验结果 | 第47-53页 |
| 7.1 重组腺病毒扩增纯化后的滴度 | 第47-48页 |
| 7.2 鼠血清中IFN-γ、、IL-2、IL-4、IL-17四种细胞因子变化水平结果 | 第48-49页 |
| 7.2.1 IFN-γ | 第48页 |
| 7.2.2 IL-17 | 第48-49页 |
| 7.3 鼠血清中总IgG抗体及IgG1和IgG2a抗体亚类变化水平结果 | 第49-50页 |
| 7.4 鼠脾T淋巴细胞CD4~+T和CD8~+T细胞亚群流式分析结果 | 第50-52页 |
| 7.5 鼠脾细胞中四种细胞因子Real-time PCR相对定量检测结果 | 第52-53页 |
| 8 讨论 | 第53-61页 |
| 8.1 肺孢子菌(肺炎)防治现状讨论 | 第53-54页 |
| 8.2 课题前期相关研究讨论 | 第54页 |
| 8.3 腺病毒载体讨论 | 第54-57页 |
| 8.4 p55TAG腺病毒载体疫苗免疫原性讨论 | 第57-59页 |
| 8.4.1 T淋巴细胞亚群分析 | 第57页 |
| 8.4.2 相关细胞因子分析 | 第57-59页 |
| 8.4.3 B淋巴细胞相关抗体分析 | 第59页 |
| 8.5 不足与展望 | 第59-61页 |
| 9 结论 | 第61-62页 |
| 本研究创新性的自我评价 | 第62-63页 |
| 参考文献 | 第63-68页 |
| 综述 | 第68-78页 |
| 参考文献 | 第73-78页 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 | 第78-79页 |
| 致谢 | 第79-80页 |
| 个人简历 | 第80页 |
