| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-13页 |
| 第1章 文献综述 | 第13-22页 |
| ·毕赤酵母AOX1启动子碳源阻遏 | 第13-16页 |
| ·毕赤酵母表达系统 | 第13-14页 |
| ·毕赤酵母表达系统的发展及其优点 | 第13页 |
| ·毕赤酵母表达系统的主要问题 | 第13-14页 |
| ·酵母中碳源阻遏现象 | 第14页 |
| ·毕赤酵母AOX1启动子的调控 | 第14-16页 |
| ·碳源阻遏机制 | 第16-20页 |
| ·酿酒酵母中葡萄糖抑制的信号转导途径 | 第16-18页 |
| ·Mig1介导的碳源阻遏机制 | 第18-20页 |
| ·毕赤酵母过氧化物酶体自噬 | 第20-21页 |
| ·本课题的研究背景及意义 | 第21-22页 |
| 第2章 己糖运载体编码基因PpHXT1和PpHXT2的功能鉴定 | 第22-37页 |
| ·前言 | 第22页 |
| ·实验材料 | 第22-23页 |
| ·菌株和质粒 | 第22页 |
| ·培养基和培养条件 | 第22-23页 |
| ·分子生物学试剂 | 第23页 |
| ·实验方法 | 第23-25页 |
| ·毕赤酵母总蛋白的提取 | 第23页 |
| ·AOX酶活以及SDS-PAGE/Western blotting分析 | 第23-24页 |
| ·毕赤酵母总RNA的提取 | 第24页 |
| ·反转录PCR制备cDNA | 第24页 |
| ·实时定量PCR测定基因PpHXT1和PpHXT2转录水平 | 第24页 |
| ·酿酒酵母醋酸锂转化法 | 第24-25页 |
| ·蓝色荧光标记过氧化物酶体菌株的构建 | 第25页 |
| ·结果与讨论 | 第25-36页 |
| ·PpHXT1和PpHXT2基因序列的生物信息学分析 | 第25-28页 |
| ·己糖运载体PpHxt1和PpHxt2二维结构分析 | 第25-27页 |
| ·毕赤酵母PpHxt1和PpHxt2进化分析 | 第27-28页 |
| ·酿酒酵母异源回补实验 | 第28-29页 |
| ·异源表达质粒pZP10和pZP20的构建 | 第28-29页 |
| ·毕赤酵母己糖运载体表达质粒回补酿酒酵母hxt-null菌株 | 第29页 |
| ·葡萄糖浓度对于PpHXT1和PpHXT2转录水平的调控 | 第29-31页 |
| ·毕赤酵母Δhxt1和Δhxt2突变株的生长特性 | 第31-32页 |
| ·Δhxt1和Δhxt2突变株在毕赤酵母己糖代谢过程中的作用 | 第32-33页 |
| ·PpHXT1和PpHXT2在AOX1启动子碳源阻遏中的作用 | 第33-34页 |
| ·PpHXT1的敲除使果糖和葡萄糖可以诱导AOX1的表达 | 第33页 |
| ·果糖和葡萄糖诱导AOX1表达酶活的定量测定 | 第33页 |
| ·AOX1蛋白的Western blotting检测 | 第33-34页 |
| ·果糖和葡萄糖诱导AOX1表达发生在转录水平 | 第34-36页 |
| ·小结 | 第36-37页 |
| 第3章 Δatg30Δhxt1菌株的构建以及糖诱导分析 | 第37-49页 |
| ·前言 | 第37页 |
| ·实验材料 | 第37页 |
| ·实验方法 | 第37-39页 |
| ·FM 4-64标记液泡 | 第37页 |
| ·毕赤酵母GFP表达菌株的构建 | 第37-38页 |
| ·毕赤酵母GFP单拷贝表达菌株的筛选 | 第38页 |
| ·流式细胞仪检测GFP表达量 | 第38-39页 |
| ·结果与讨论 | 第39-47页 |
| ·Δatg30Δhxt1双敲除菌株的构建 | 第39-41页 |
| ·PpHXT1敲除载体的构建 | 第39页 |
| ·PpHXT1敲除片段的获得 | 第39-40页 |
| ·Δatg30Δhxt1双敲除菌株筛选及PCR验证 | 第40-41页 |
| ·载体pP-GFP和pP-GS的构建 | 第41-42页 |
| ·绿色荧光蛋白表达菌株的筛选 | 第42页 |
| ·Δhxt1-GFP,Δhxt1-GFP-SKL,Δatg30Δhxt1-GFP-SKL菌株GFP拷贝数的测定 | 第42-45页 |
| ·可利用果糖或葡萄糖诱导AOX1启动子表达GFP的毕赤酵母菌株 | 第45-47页 |
| ·PpATG30基因的敲除对于毕赤酵母过氧化物酶体自噬的影响 | 第45-46页 |
| ·过氧化物酶体自噬在Δhxt1菌株AOX1启动子碳源阻遏中的作用 | 第46-47页 |
| ·小结 | 第47-49页 |
| 第4章 碳源阻遏因子编码基因PpMIG1和PpMIG2的克隆与序列分析 | 第49-58页 |
| ·前言 | 第49页 |
| ·实验材料 | 第49页 |
| ·实验方法 | 第49-51页 |
| ·MIG简并引物的设计 | 第49页 |
| ·简并PCR获得核心片段 | 第49页 |
| ·运用Genome walking获得基因全长以及侧翼序列 | 第49-50页 |
| ·基因序列分析和进化树的构建 | 第50-51页 |
| ·大肠杆菌Top 10感受态细胞的制备及转化 | 第51页 |
| ·结果与讨论 | 第51-57页 |
| ·毕赤酵母MIG基因简并引物的设计 | 第51页 |
| ·PpMIG1和PpMIG2基因核心片段的克隆 | 第51-53页 |
| ·PpMIG1和PpMIG2基因全长以及侧翼序列的获得 | 第53-54页 |
| ·毕赤酵母MIG基因序列分析 | 第54-57页 |
| ·小结 | 第57-58页 |
| 第5章 Δmig1和Δmig2菌株的构建 | 第58-71页 |
| ·前言 | 第58页 |
| ·实验材料 | 第58-59页 |
| ·实验方法 | 第59-61页 |
| ·毕赤酵母感受态制备及电穿孔转化 | 第59-60页 |
| ·毕赤酵母基因组的抽提 | 第60页 |
| ·引物设计以及PCR反应条件 | 第60-61页 |
| ·结果与讨论 | 第61-70页 |
| ·PpMIGI体外敲除片段的构建 | 第61-64页 |
| ·载体pUC18Mi1 5’和pUC18Mi1 3’的构建 | 第61-62页 |
| ·载体pUC18Mi1 5'-Ble的构建 | 第62-63页 |
| ·载体pUC18Mi1 5'-ble-Mi1 3’的构建 | 第63-64页 |
| ·毕赤酵母Δmig1敲除株的构建 | 第64-66页 |
| ·PpMIG1敲除片段Mil 5'-ble-Mil 3’的获得 | 第64页 |
| ·PpMIG1敲除片段电转毕赤酵母GS115感受态 | 第64页 |
| ·毕赤酵母Δmig1敲除株的筛选及PCR验证 | 第64-66页 |
| ·PpMIG2体外敲除片段的构建 | 第66-68页 |
| ·载体pUC18Mi2 5’和pUC18Mi2 3’的构建 | 第66页 |
| ·载体pUC18Mi2 5’-KAN的构建 | 第66-67页 |
| ·载体pUC18Mi2 5'-KAN·Mi2 3’的构建 | 第67-68页 |
| ·毕赤酵母Δmig2敲除株的构建 | 第68-70页 |
| ·PpMIG2敲除片段Mi2 5'-KAN-Mi2 3’的获得 | 第68-69页 |
| ·PpMIG2敲除片段电转毕赤酵母GS115感受态 | 第69页 |
| ·毕赤酵母Δmig2敲除株的筛选及PCR验证 | 第69-70页 |
| ·小结 | 第70-71页 |
| 第6章 Δmig1Δmig2双敲除菌株的构建 | 第71-77页 |
| ·前言 | 第71页 |
| ·实验材料 | 第71-72页 |
| ·实验方法 | 第72-74页 |
| ·交配及双倍体的筛选 | 第72-73页 |
| ·孢子的形成与分析 | 第73-74页 |
| ·结果与讨论 | 第74-76页 |
| ·Δmig1Δmig2双敲除菌株的PCR验证 | 第74-75页 |
| ·4号菌株摇瓶扩大培养和再验证 | 第75-76页 |
| ·小结 | 第76-77页 |
| 第7章 碳源阻遏因子编码基因PpMIG1和PpMIG2的功能鉴定 | 第77-86页 |
| ·前言 | 第77页 |
| ·实验材料 | 第77页 |
| ·实验方法 | 第77页 |
| ·结果与讨论 | 第77-85页 |
| ·PpMIG和PpMIG2的敲除在毕赤酵母葡萄糖阻遏中的作用 | 第77页 |
| ·PpMIG1和PpMIG2在AOX1启动子碳源阻遏中的作用 | 第77-79页 |
| ·PpMIG1和PpMIG2的敲除使果糖和葡萄糖可以诱导AOX1蛋白的表达 | 第77-78页 |
| ·甘油诱导AOX1表达酶活的定量测定 | 第78-79页 |
| ·AOX1蛋白的Western blotting检测 | 第79页 |
| ·Δmig1Δmig2Δatg30三敲除菌株的构建 | 第79-83页 |
| ·PpATG30敲除载体的构建 | 第79-81页 |
| ·PpATG30敲除片段ATG30Up-hph-ATG30Down的获得 | 第81-82页 |
| ·Δmig1Δmig2Δatg30三敲除菌株筛选及PCR验证 | 第82-83页 |
| ·Δmig1Δmig2-GFP、Δmig1Δmig2-GFP-SKL和Δmig1Δmig2Δatg30-GFP-SKL单拷贝菌株筛选 | 第83-84页 |
| ·过氧化物酶体自噬在Δmig1Δmig2菌株AOX1启动子碳源阻遏中的作用 | 第84-85页 |
| ·小结 | 第85-86页 |
| 第8章 结论与展望 | 第86-88页 |
| ·结论 | 第86-87页 |
| ·展望 | 第87-88页 |
| 参考文献 | 第88-93页 |
| 硕士期间的论文发表与专利申请 | 第93-94页 |
| 致谢 | 第94-95页 |
| 附录1 实验中所用菌株 | 第95-96页 |
