| 摘要 | 第6-8页 |
| abstract | 第8-9页 |
| 第一章 研究背景及文献综述 | 第13-34页 |
| 1.1 基因组定点编辑 | 第13页 |
| 1.2 人工核酸酶技术的发展 | 第13-22页 |
| 1.2.1 锌指核酸酶技术 | 第14-16页 |
| 1.2.2 类转录激活因子核酸酶技术 | 第16-18页 |
| 1.2.3 CRISPR/Cas9核酸酶技术 | 第18-22页 |
| 1.3 CRISPR/Cas9及其衍生技术在基因组多位点编辑中的研究 | 第22-25页 |
| 1.4 DNA双链断裂修复及提高同源重组效率的方法 | 第25-29页 |
| 1.4.1 DNA双链断裂的修复机制及相互关系 | 第26-27页 |
| 1.4.2 提高同源重组效率的方法 | 第27-29页 |
| 1.5 CRISPR/Cas9技术在畜禽育种研究中的应用 | 第29-32页 |
| 1.5.1 CRISPR/Cas9技术在家畜育种研究的应用 | 第29-32页 |
| 1.5.2 CRISPR/Cas9技术在家禽育种研究的应用 | 第32页 |
| 1.6 本研究的意义 | 第32-34页 |
| 第二章 基于Drosha识别位点的sgRNA-shRNA串联表达系统的初步构建 | 第34-53页 |
| 2.1 试验材料 | 第35-37页 |
| 2.1.1 菌株,质粒与细胞系 | 第35-36页 |
| 2.1.2 主要试剂材料及其配制 | 第36页 |
| 2.1.3 主要仪器 | 第36页 |
| 2.1.4 引物 | 第36-37页 |
| 2.2 试验方法 | 第37-46页 |
| 2.2.1 靶位点选择和载体的准备 | 第37-45页 |
| 2.2.2 HEK293T细胞的培养 | 第45页 |
| 2.2.3 HEK293T细胞转染 | 第45-46页 |
| 2.2.4 CRISPR/Cas9系统工作效率统计 | 第46页 |
| 2.3 结果 | 第46-50页 |
| 2.3.1 msRNAs串联表达载体构建 | 第46-47页 |
| 2.3.2 II型启动子CMV驱动msRNAs串联结构表达多个sgRNA的活性验证 | 第47-49页 |
| 2.3.3 III型启动子U6驱动msRNAs串联结构表达多个sgRNA的活性验证 | 第49-50页 |
| 2.4 讨论 | 第50-52页 |
| 2.5 小结 | 第52-53页 |
| 第三章 sgRNA-shRNA技术介导基因组多位点打靶潜力的研究 | 第53-69页 |
| 3.1 试验材料 | 第54-55页 |
| 3.1.1 菌株,质粒与细胞系 | 第54页 |
| 3.1.2 主要试剂材料及其配制 | 第54页 |
| 3.1.3 主要仪器 | 第54页 |
| 3.1.4 引物和序列 | 第54-55页 |
| 3.2 试验方法 | 第55-60页 |
| 3.2.1 靶向三个基因组位点的质粒msRNA-3的构建 | 第55-56页 |
| 3.2.2 HEK293T细胞的培养 | 第56页 |
| 3.2.3 HEK293T基因组多位点打靶实验的细胞转染 | 第56-57页 |
| 3.2.4 HEK293T细胞的筛选及单克隆的挑取 | 第57-59页 |
| 3.2.5 细胞基因组的提取 | 第59页 |
| 3.2.6 HEK293T细胞基因组靶序列片段的扩增 | 第59-60页 |
| 3.2.7 HEK293T基因组靶位点附近突变的测序检测 | 第60页 |
| 3.3 结果 | 第60-67页 |
| 3.3.1 质粒msRNA-3的构建结果 | 第60-61页 |
| 3.3.2 嘌呤霉素筛选转染后的HEK293T细胞的结果 | 第61页 |
| 3.3.3 初步验证实验的TA克隆测序结果 | 第61-63页 |
| 3.3.4 靶向单个细胞中三个基因组位点的测序结果 | 第63-67页 |
| 3.4 讨论 | 第67-68页 |
| 3.5 小结 | 第68-69页 |
| 第四章 sgRNA-shRNA技术介导的基因组精确编辑研究 | 第69-84页 |
| 4.1 试验材料 | 第71-72页 |
| 4.1.1 菌株,质粒与细胞系 | 第71页 |
| 4.1.2 主要试剂及其配制 | 第71页 |
| 4.1.3 主要仪器 | 第71页 |
| 4.1.4 引物及LIG4shRNA的基因序列 | 第71-72页 |
| 4.2 试验方法 | 第72-77页 |
| 4.2.1 质粒msRNA-ACA和msRNA-ALA的构建 | 第72-74页 |
| 4.2.2 同源修复模板供体载体的构建 | 第74-75页 |
| 4.2.3 检测质粒msRNA-ALA能否抑制细胞中LIG4基因的表达 | 第75-76页 |
| 4.2.4 HEK293T细胞基因组AAVS1基因精确编辑实验的转染分组 | 第76页 |
| 4.2.5 嘌呤霉素筛选、细胞单克隆的挑取及其基因组的提取 | 第76-77页 |
| 4.2.6 包含靶位点的基因组片段的扩增 | 第77页 |
| 4.2.7 EcoRI酶切检测及各组中HDR阳性细胞概率的统计 | 第77页 |
| 4.2.8 对HDR修复是否发生在两条等位基因的探究 | 第77页 |
| 4.3 结果 | 第77-82页 |
| 4.3.1 质粒msRNA-ACA和msRNA-ALA的构建 | 第77-78页 |
| 4.3.2 质粒pBlue-AAVS1(EcoRI).donor的构建 | 第78-79页 |
| 4.3.3 质粒msRNA-ALA对LIG4基因的作用结果 | 第79页 |
| 4.3.4 质粒msRNA-ALA和msRNA-ACA对同源重组效率的影响 | 第79-81页 |
| 4.3.5 HDR阳性细胞内两个等位基因都发生HDR修复效率的检测结果 | 第81-82页 |
| 4.4 讨论 | 第82页 |
| 4.5 小结 | 第82-84页 |
| 第五章 sgRNA-shRNA技术在鸡基因组编辑中的应用研究 | 第84-101页 |
| 5.1 试验材料 | 第85-86页 |
| 5.1.1 菌株,质粒与细胞系 | 第85页 |
| 5.1.2 主要试剂及其配制 | 第85页 |
| 5.1.3 主要仪器 | 第85页 |
| 5.1.4 引物 | 第85-86页 |
| 5.2 试验方法 | 第86-92页 |
| 5.2.1 鸡细胞基因组中靶位点的选择以及msRNAs串联结构的优化 | 第86-88页 |
| 5.2.2 质粒APO-Cas9的构建 | 第88-89页 |
| 5.2.3 DF-1细胞的培养和传代 | 第89页 |
| 5.2.4 嘌呤霉素筛选DF-1细胞的最佳筛选条件探索 | 第89-90页 |
| 5.2.5 DF-1细胞的转染 | 第90-91页 |
| 5.2.6 DF-1细胞转染后的传代和嘌呤霉素筛选 | 第91页 |
| 5.2.7 试验组DF-1细胞单克隆的挑取 | 第91页 |
| 5.2.8 试验组DF-1细胞单克隆基因组DNA的提取 | 第91页 |
| 5.2.9 试验组细胞单克隆基因组靶序列的扩增及打靶效果检测 | 第91-92页 |
| 5.3 结果 | 第92-99页 |
| 5.3.1 质粒APO-Cas9的构建 | 第92-93页 |
| 5.3.2 嘌呤霉素筛选DF-1细胞的最佳筛选条件 | 第93-95页 |
| 5.3.3 DF-1细胞的转染、筛选及荧光的观察 | 第95-96页 |
| 5.3.4 APO-Cas9打靶基因组的工作效率 | 第96-99页 |
| 5.4 讨论 | 第99-100页 |
| 5.5 小结 | 第100-101页 |
| 结论与创新点 | 第101-103页 |
| 缩略词 | 第103-105页 |
| 参考文献 | 第105-116页 |
| 致谢 | 第116-118页 |
| 作者简介 | 第118-119页 |
