| 摘要 | 第6-9页 |
| ABSTRACT | 第9-11页 |
| 第一章 文献综述 | 第16-40页 |
| 1.1 神经嵴细胞发育成肠神经节细胞和黑色素细胞 | 第16-19页 |
| 1.1.1 神经嵴的形成 | 第16-17页 |
| 1.1.2 神经嵴细胞发育成肠神经节细胞 | 第17-18页 |
| 1.1.3 神经嵴细胞发育成黑色素细胞 | 第18-19页 |
| 1.2 先天性巨结肠症研究进展 | 第19-26页 |
| 1.2.1 RET/GDNF信号传导通路 | 第20-21页 |
| 1.2.2 内皮素信号通路 | 第21-22页 |
| 1.2.3 转录因子 | 第22-23页 |
| 1.2.4 HSCR相关基因的相互作用 | 第23-25页 |
| 1.2.5 RNA调控 | 第25-26页 |
| 1.3 色素异常研究进展 | 第26-37页 |
| 1.3.1 黑色素的生成及意义 | 第26-29页 |
| 1.3.2 黑色素细胞发育研究进展 | 第29-37页 |
| 1.4 研究目的和意义 | 第37-40页 |
| 1.4.1 大鼠模型 | 第37-38页 |
| 1.4.2 研究的目的 | 第38-39页 |
| 1.4.3 研究的意义 | 第39-40页 |
| 实验研究 | 第40-115页 |
| 第二章 利用大鼠模型进行HSCR相关QTL定位 | 第40-49页 |
| 2.1 材料与方法 | 第40-42页 |
| 2.1.1 实验动物 | 第40页 |
| 2.1.2 试剂与材料 | 第40页 |
| 2.1.3 全肠染色 | 第40-41页 |
| 2.1.4 微卫星标记的筛选 | 第41页 |
| 2.1.5 基因分型 | 第41-42页 |
| 2.1.6 数据处理 | 第42页 |
| 2.2 结果与分析 | 第42-48页 |
| 2.2.1 全肠染色 | 第42-43页 |
| 2.2.2 多态性微卫星标记的筛选 | 第43-45页 |
| 2.2.3 F2代个体微卫星标记分型 | 第45-46页 |
| 2.2.4 数据处理结果 | 第46-48页 |
| 2.3 讨论 | 第48页 |
| 2.4 小结 | 第48-49页 |
| 第三章 HSCR显著相关的QTL区域相关基因筛选及多态性研究 | 第49-62页 |
| 3.1 材料与方法 | 第49-51页 |
| 3.1.1 实验动物 | 第49页 |
| 3.1.2 实验材料与试剂 | 第49-50页 |
| 3.1.3 Chr 2 上QTL区域相关候选基因的筛选 | 第50页 |
| 3.1.4 候选基因多态位点筛选 | 第50页 |
| 3.1.5 多态性位点酶切分型 | 第50-51页 |
| 3.1.6 数据分析 | 第51页 |
| 3.2 结果与分析 | 第51-60页 |
| 3.2.1 Chr 2 上QTL位点置信区间内HSCR相关基因的筛选 | 第51-52页 |
| 3.2.2 候选基因启动子及外显子序列多态性筛选 | 第52-58页 |
| 3.2.3 酶切分型 | 第58-60页 |
| 3.3 讨论 | 第60-61页 |
| 3.4 小结 | 第61-62页 |
| 第四章 Gdnf基因启动子活性分析 | 第62-71页 |
| 4.1 材料与方法 | 第62-66页 |
| 4.1.1 实验材料与试剂 | 第62-65页 |
| 4.1.2 最佳共转染比例的摸索 | 第65-66页 |
| 4.1.3 Gdnf基因启动子不同片段转录活性的检测 | 第66页 |
| 4.1.4 LEF1转录因子对P2-AGH片段启动子活性的影响 | 第66页 |
| 4.1.5 数据统计与分析 | 第66页 |
| 4.2 结果与分析 | 第66-70页 |
| 4.2.1 Gdnf基因启动子不同片段的克隆和载体构建 | 第66-67页 |
| 4.2.2 最佳转染比例的摸索 | 第67-68页 |
| 4.2.3 核心启动子区活性检测 | 第68页 |
| 4.2.4 突变位点截断片段转录活性检测 | 第68-69页 |
| 4.2.5 转录因子LEF1对g.56886933 C＞T位点的效应检测 | 第69-70页 |
| 4.3 讨论 | 第70页 |
| 4.4 小结 | 第70-71页 |
| 第五章 色素异常相关QTL定位 | 第71-79页 |
| 5.1 材料与方法 | 第71-72页 |
| 5.1.1 实验动物 | 第71页 |
| 5.1.2 试剂与材料 | 第71页 |
| 5.1.3 毛色表型的测定及分析 | 第71-72页 |
| 5.1.4 微卫星标记的筛选和基因分型 | 第72页 |
| 5.1.5 数据处理 | 第72页 |
| 5.2 结果与分析 | 第72-77页 |
| 5.2.1 色素表型值的评估 | 第72-73页 |
| 5.2.2 色素异常相关QTL分析 | 第73-76页 |
| 5.2.3 色素异常相关QTL位点等位基因效应分析 | 第76-77页 |
| 5.3 讨论 | 第77-78页 |
| 5.4 小结 | 第78-79页 |
| 第六章 色素异常相关候选基因筛选及多态性研究 | 第79-86页 |
| 6.1 材料与方法 | 第79页 |
| 6.1.1 实验动物与试剂 | 第79页 |
| 6.1.2 置信区间内色素异常相关候选基因的筛选 | 第79页 |
| 6.1.3 候选基因启动子及外显子序列多态性筛选 | 第79页 |
| 6.2 结果与分析 | 第79-83页 |
| 6.2.1 黑色素细胞发育相关基因的筛选 | 第79-80页 |
| 6.2.2 候选基因启动子及外显子序列多态性筛选 | 第80-83页 |
| 6.3 讨论 | 第83-85页 |
| 6.4 小结 | 第85-86页 |
| 第七章 大鼠神经胶质细胞瘤细胞系Ednrb和Gdnf基因单敲除稳定细胞株的筛选 | 第86-97页 |
| 7.1 材料与方法 | 第86-89页 |
| 7.1.1 材料 | 第86页 |
| 7.1.2 靶位点的设计及引物合成 | 第86-87页 |
| 7.1.3 载体的构建 | 第87-88页 |
| 7.1.4 打靶gRNA活性验证 | 第88页 |
| 7.1.5 稳定敲除细胞株的筛选 | 第88-89页 |
| 7.2 结果 | 第89-95页 |
| 7.2.1 靶位点的设计与打靶载体引物、突变检测引物的合成 | 第89-91页 |
| 7.2.2 载体构建 | 第91-94页 |
| 7.2.3 靶位点gRNA活性验证 | 第94页 |
| 7.2.4 单克隆基因敲除细胞株的筛选与鉴定 | 第94-95页 |
| 7.3 讨论 | 第95-96页 |
| 7.4 小结 | 第96-97页 |
| 第八章 利用CRISPR/Cas9技术制作Ednrb和Gdnf基因敲除小鼠 | 第97-115页 |
| 8.1 材料与方法 | 第97-103页 |
| 8.1.1 实验动物 | 第97-98页 |
| 8.1.2 试剂与材料 | 第98页 |
| 8.1.3 靶位点选择及引物设计 | 第98页 |
| 8.1.4 载体构建和打靶效率验证 | 第98-99页 |
| 8.1.5 体外转录 | 第99-102页 |
| 8.1.6 荧光染料、质粒的准备 | 第102页 |
| 8.1.7 小鼠超排 | 第102页 |
| 8.1.8 小鼠离体胚胎的电转及移植 | 第102页 |
| 8.1.9 原位胚胎的电转 | 第102-103页 |
| 8.1.10 突变位点的检测 | 第103页 |
| 8.2 结果 | 第103-111页 |
| 8.2.1 引物设计 | 第103页 |
| 8.2.2 载体构建及gRAN活性检测 | 第103-106页 |
| 8.2.3 体外转录 | 第106-107页 |
| 8.2.4 质粒和mRNA活性测试 | 第107页 |
| 8.2.5 小鼠胚胎离体电转 | 第107-111页 |
| 8.2.6 小鼠原位胚胎电转 | 第111页 |
| 8.3 讨论 | 第111-113页 |
| 8.4 小结 | 第113-115页 |
| 结论 | 第115-117页 |
| 创新点 | 第117-118页 |
| 下一步计划 | 第118-119页 |
| 参考文献 | 第119-140页 |
| 附录 | 第140-158页 |
| 致谢 | 第158-159页 |
| 作者简介 | 第159页 |
