| 中文摘要 | 第4-5页 |
| ABSTRACT | 第5页 |
| 缩略词 | 第6-11页 |
| 第一章 绪论 | 第11-15页 |
| 1 铜绿假单胞菌 | 第11-12页 |
| 1.1 P.aeruginosa的毒力 | 第11页 |
| 1.2 P.aeruginosa的耐药性 | 第11-12页 |
| 2 细菌蛋白质磷酸化的相关研究 | 第12-13页 |
| 3 PpkA等Ser/Thr蛋白激酶的研究现状 | 第13-14页 |
| 4 研究目的与意义 | 第14-15页 |
| 第二章 ppk A、stk1、PA1782基因表达载体的构建及相应抗体的制备 | 第15-38页 |
| 1 前言 | 第15页 |
| 2 实验材料、试剂和仪器 | 第15-18页 |
| 2.1 实验材料 | 第15页 |
| 2.2 实验试剂 | 第15-16页 |
| 2.3 实验仪器 | 第16-17页 |
| 2.4 主要溶液配制 | 第17-18页 |
| 3 方法 | 第18-30页 |
| 3.1 铜绿假单胞菌基因组的提取 | 第18-19页 |
| 3.2 引物设计 | 第19页 |
| 3.3 基因扩增 | 第19-21页 |
| 3.4 pET-28a(+)质粒的提取 | 第21-22页 |
| 3.5 基因双酶切 | 第22-23页 |
| 3.6 质粒双酶切 | 第23-24页 |
| 3.7 质粒与基因片段酶切连接 | 第24-25页 |
| 3.8 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备 | 第25页 |
| 3.9 连接产物转化DH5α感受态细胞 | 第25-26页 |
| 3.10 重组质粒的筛选和鉴定 | 第26-27页 |
| 3.10.1 重组质粒的双酶切鉴定 | 第26-27页 |
| 3.10.2 重组质粒的测序鉴定 | 第27页 |
| 3.11 目的基因的诱导表达及纯化 | 第27-29页 |
| 3.11.1 stk1的诱导表达及纯化 | 第27-28页 |
| 3.11.2 PA1782的诱导表达及纯化 | 第28-29页 |
| 3.12 抗体的制备 | 第29-30页 |
| 3.12.1 抗原的制备 | 第29页 |
| 3.12.2 免疫小鼠 | 第29页 |
| 3.12.3 Dot-Blot方法测定抗血清效价 | 第29-30页 |
| 3.13 抗血清的获取 | 第30页 |
| 4 结果 | 第30-36页 |
| 4.1 PCR扩增 ppkA、stk1、PA1782 基因 | 第30-31页 |
| 4.2 重组质粒的鉴定 | 第31-33页 |
| 4.3 目的基因的诱导表达及纯化 | 第33-35页 |
| 4.3.1 stk1的诱导表达及纯化 | 第33-34页 |
| 4.3.2 PA1782的诱导表达及纯化 | 第34-35页 |
| 4.4 Dot-Blot方法测定抗血清效价 | 第35-36页 |
| 4.4.1 Dot-Blot方法测定Stk1抗血清效价 | 第35-36页 |
| 4.4.2 Dot-Blot方法测定PA1782抗血清效价 | 第36页 |
| 5 讨论 | 第36-38页 |
| 第三章 PpkA对P. aeruginosa毒力的调控作用 | 第38-52页 |
| 1 前言 | 第38页 |
| 2 材料 | 第38-39页 |
| 2.1 菌株和质粒 | 第38页 |
| 2.2 实验试剂 | 第38-39页 |
| 2.3 实验仪器 | 第39页 |
| 3 方法 | 第39-44页 |
| 3.1 对Hela细胞侵袭力的差异比较 | 第39-41页 |
| 3.1.1 Hela细胞复苏 | 第39-40页 |
| 3.1.2 细胞铺板 | 第40页 |
| 3.1.3 侵袭Hela细胞后平板计数 | 第40-41页 |
| 3.2 对生菜的毒力差异比较 | 第41页 |
| 3.3 绿脓菌素产生的差异比较 | 第41页 |
| 3.4 生物被膜产量差异比较 | 第41-42页 |
| 3.5 抗氧化应激能力的差异比较 | 第42-43页 |
| 3.5.1 MTT法比较PAO1、△ppk A抗不同浓度H_2O_2的能力 | 第42页 |
| 3.5.2 比较PAO1、△ppkA在 50 mM H_2O_2应激处理下的存活情况 | 第42-43页 |
| 3.6 抗高渗环境的差异比较 | 第43页 |
| 3.7 在不同营养环境中生长情况的差异 | 第43-44页 |
| 4 结果 | 第44-50页 |
| 4.1 对Hela细胞侵袭力的差异比较 | 第44页 |
| 4.2 对生菜毒力差异比较 | 第44-45页 |
| 4.3 对绿脓菌素产生的差异比较 | 第45-46页 |
| 4.4 生物被膜产量差异比较 | 第46页 |
| 4.5 抗氧化应激能力的差异比较 | 第46-48页 |
| 4.5.1 MTT法比较PAO1、△ppk A抗不同浓度H_2O_2的能力 | 第47页 |
| 4.5.2 比较PAO1、△ppkA在 50 mM H_2O_2应激处理下的存活情况 | 第47-48页 |
| 4.6 抗高渗环境的差异比较 | 第48-49页 |
| 4.7 不同营养环境中生长曲线测定 | 第49-50页 |
| 5 讨论 | 第50-52页 |
| 第四章 PpkA对P. aeruginosa耐药性的调控作用 | 第52-65页 |
| 1 前言 | 第52页 |
| 2 材料 | 第52-53页 |
| 2.1 菌株 | 第52页 |
| 2.2 实验试剂 | 第52-53页 |
| 2.3 实验仪器 | 第53页 |
| 3 方法 | 第53-57页 |
| 3.1 P. aeruginosa耐药菌的诱导 | 第53-54页 |
| 3.2 PAO1和PAO1-R中Ser、Thr磷酸化差异比较 | 第54-55页 |
| 3.2.1 蛋白样品制备及SDS-PAGE | 第54页 |
| 3.2.2 Western Blot | 第54-55页 |
| 3.3 Stk1、PA1782在PAO1和PAO1-R中的差异表达 | 第55-56页 |
| 3.3.1 蛋白样品制备及SDS-PAGE | 第55页 |
| 3.3.2 Western Blot | 第55-56页 |
| 3.4 检测PAO1、△ppk A对三种抗生素MIC的差异 | 第56页 |
| 3.5 PAO1和△ppk A膜蛋白中Ser、Thr磷酸化差异比较 | 第56页 |
| 3.6 Stk1、PA1782在PAO1和△ppk A中的差异表达 | 第56页 |
| 3.6.1 蛋白样品制备及SDS-PAGE | 第56页 |
| 3.6.2 Western Blot | 第56页 |
| 3.7 MTT法检测在抗生素次抑菌浓度诱导下生物膜产量差异 | 第56-57页 |
| 3.7.1 MTT法检测头孢他啶次抑菌浓度诱导下生物膜形成差异 | 第56-57页 |
| 3.7.2 MTT法检测庆大霉素次抑菌浓度诱导下生物膜形成差异 | 第57页 |
| 3.7.3 MTT法检测亚胺培南次抑菌浓度诱导下生物膜形成差异 | 第57页 |
| 4 结果 | 第57-63页 |
| 4.1 P. aeruginosa耐药菌的诱导 | 第57页 |
| 4.2 PAO1和PAO1-R中Ser、Thr磷酸化差异比较 | 第57-58页 |
| 4.3 Stk1、PA1782在PAO1和PAO1-R中的差异表达 | 第58-59页 |
| 4.4 检测PAO1、△ppk A对三种抗生素MIC的差异 | 第59页 |
| 4.5 PAO1和△ppk A膜蛋白中Ser、Thr磷酸化差异比较 | 第59-60页 |
| 4.6 Stk1、PA1782在PAO1和△ppk A中的差异表达 | 第60-61页 |
| 4.7 MTT法检测在抗生素次抑菌浓度诱导下生物膜产量差异 | 第61-63页 |
| 5 讨论 | 第63-65页 |
| 第五章 结论与展望 | 第65-66页 |
| 1 结论 | 第65页 |
| 2 展望 | 第65-66页 |
| 参考文献 | 第66-72页 |
| 攻读学位期间的研究成果 | 第72-73页 |
| 致谢 | 第73页 |
