| 摘要 | 第6-8页 |
| ABSTRACT | 第8-9页 |
| 英文缩写表 | 第17-18页 |
| 第一章 绪论 | 第18-34页 |
| 1.1 丙型肝炎与丙型肝炎病毒 | 第18-21页 |
| 1.1.1 丙型肝炎 | 第18页 |
| 1.1.2 丙型肝炎病毒 | 第18-21页 |
| 1.2 丙型肝炎病毒的感染与复制机制 | 第21-24页 |
| 1.2.1 CD81受体 | 第21-22页 |
| 1.2.2 SR-BⅠ受体 | 第22-23页 |
| 1.2.3 Claudin-1受体 | 第23页 |
| 1.2.4 Occludin受体 | 第23页 |
| 1.2.5 LDLR受体 | 第23-24页 |
| 1.3 丙型肝炎病毒细胞模型 | 第24-25页 |
| 1.4 丙型肝炎动物模型 | 第25-28页 |
| 1.4.1 黑猩猩(chimpanzee) | 第25-26页 |
| 1.4.2 猴(monkey) | 第26页 |
| 1.4.3 小鼠(rat) | 第26-27页 |
| 1.4.4 树鼩(tree shrew, Tupaia belangeri) | 第27-28页 |
| 1.5 原代肝细胞的分离培养技术 | 第28-32页 |
| 1.5.1 原代肝细胞分离方法 | 第28-30页 |
| 1.5.2 原代肝细胞培养方法 | 第30-31页 |
| 1.5.3 树鼩原代肝细胞分离培养 | 第31-32页 |
| 1.5.4 原代肝细胞的应用 | 第32页 |
| 1.6 本研究的意义 | 第32-33页 |
| 1.7 试验技术路线图 | 第33-34页 |
| 第二章 树鼩原代肝细胞的分离培养 | 第34-51页 |
| 2.1 引言 | 第34-35页 |
| 2.2 材料与方法 | 第35-40页 |
| 2.2.1 实验动物 | 第35页 |
| 2.2.2 实验药品与试剂 | 第35-36页 |
| 2.2.3 实验仪器 | 第36-37页 |
| 2.2.4 两步灌流法分离树鼩原代肝细胞 | 第37页 |
| 2.2.5 灌流液及离心速度的优化 | 第37页 |
| 2.2.6 原代肝细胞培养条件优化 | 第37-38页 |
| 2.2.7 优化后得到的肝细胞状态及增殖情况 | 第38-40页 |
| 2.2.7.1 细胞得率及活细胞率计算 | 第38页 |
| 2.2.7.2 MTT法检测绘制细胞生长曲线 | 第38-39页 |
| 2.2.7.3 EDU染料法观察细胞增值情况 | 第39-40页 |
| 2.3 实验结果 | 第40-47页 |
| 2.3.1 灌流液对分离细胞得率和细胞活力的影响 | 第40-41页 |
| 2.3.2 离心速度及时间比较 | 第41-42页 |
| 2.3.3 细胞培养板胶原处理前后的比较 | 第42页 |
| 2.3.4 维持培养基的优化 | 第42-43页 |
| 2.3.5 MTT法绘制细胞生长曲线 | 第43-44页 |
| 2.3.6 EDU染料法测定细胞增值情况 | 第44-46页 |
| 2.3.7 条件优化后细胞培养状态 | 第46-47页 |
| 2.4 讨论 | 第47-49页 |
| 2.4.1 分离条件对细胞状态的影响 | 第48页 |
| 2.4.2 鼠尾胶原对细胞贴壁的影响 | 第48页 |
| 2.4.3 培养条件对细胞的影响 | 第48-49页 |
| 2.4.4 细胞生长状态监测 | 第49页 |
| 2.5 本章小结 | 第49-51页 |
| 第三章 HCV (2A)对树鼩原代肝细胞的感染性研究 | 第51-67页 |
| 3.1 引言 | 第51页 |
| 3.2 材料与设备 | 第51-52页 |
| 3.2.1 实验材料 | 第51-52页 |
| 3.2.2 实验试剂 | 第52页 |
| 3.2.3 实验仪器 | 第52页 |
| 3.2.4 引物 | 第52页 |
| 3.3 实验方法 | 第52-59页 |
| 3.3.1 Huh7.5.1细胞和HCV (J6/JFH1)病毒培养 | 第52-53页 |
| 3.3.1.1 Huh7.5.1细胞的培养 | 第52-53页 |
| 3.3.1.2 HCV (J6/JFH1)病毒培养 | 第53页 |
| 3.3.2 荧光定量PCR检测J6/JFH1病毒载量 | 第53-55页 |
| 3.3.2.1 病毒RNA提取 | 第53-54页 |
| 3.3.2.2 细胞培养上清中病毒拷贝数检测 | 第54-55页 |
| 3.3.3 细胞培养上清病毒滴度检测 | 第55页 |
| 3.3.4 不同感染复数对PTH生长状态的影响 | 第55页 |
| 3.3.5 HCV感染PTH及检测 | 第55-59页 |
| 3.3.5.1 定性检测PTH感染上清中病毒RNA | 第56-58页 |
| 3.3.5.2 定量检测PTH感染上清中病毒RNA | 第58页 |
| 3.3.5.3 Western blot检测PTH中HCV蛋白表达 | 第58-59页 |
| 3.4 实验结果 | 第59-64页 |
| 3.4.1 Huh7.5.1感染上清中病毒载量和滴度检测 | 第59-60页 |
| 3.4.2 Huh7.5.1细胞培养上清病毒滴度检测 | 第60-61页 |
| 3.4.3 不同感染复数对树鼩原代肝细胞生长状态的影响 | 第61-62页 |
| 3.4.4 PTH对J6/JFH1病毒的感染性研究 | 第62-64页 |
| 3.4.4.1 PTH感染上清中的定性检测 | 第62-63页 |
| 3.4.4.2 PTH感染上清中的定量检测 | 第63-64页 |
| 3.4.4.3 PTH细胞中HCV蛋白表达检测 | 第64页 |
| 3.5 讨论 | 第64-66页 |
| 3.5.1 不同感染复数对PTH生长状态的影响 | 第64-65页 |
| 3.5.2 PTH感染上清中HCV定性检测结果分析 | 第65页 |
| 3.5.3 HCV感染PTH后定量检测结果分析 | 第65页 |
| 3.5.4 HCV感染PTH后蛋白检测结果分析 | 第65-66页 |
| 3.6 本章小结 | 第66-67页 |
| 第四章 CD81对HCV感染树鼩原代肝细胞的影响 | 第67-86页 |
| 4.1 引言 | 第67-68页 |
| 4.2 实验材料与仪器 | 第68-69页 |
| 4.2.1 实验试剂 | 第68页 |
| 4.2.2 实验仪器 | 第68-69页 |
| 4.2.3 引物 | 第69页 |
| 4.3 实验方法 | 第69-76页 |
| 4.3.1 PIRES2-CD81载体的构建 | 第69-71页 |
| 4.3.2 18T-ACTB质粒构建 | 第71页 |
| 4.3.3 质粒提取 | 第71-72页 |
| 4.3.4 CD81对HCV感染PTH的影响 | 第72-76页 |
| 4.3.4.1 树鼩原代肝细胞转染PIRES2-EGFP-CD81 | 第72-73页 |
| 4.3.4.2 细胞总RNA提取 | 第73-74页 |
| 4.3.4.3 RNA样品浓度测定 | 第74页 |
| 4.3.4.4 RNA反转录为cDNA | 第74页 |
| 4.3.4.5 样品表达量的检测 | 第74-75页 |
| 4.3.4.6 表达CD81后对HCV感染PTH的影响 | 第75-76页 |
| 4.4 实验结果 | 第76-83页 |
| 4.4.1 PIRES2-EGFP-CD81载体构建及鉴定 | 第76-77页 |
| 4.4.2 18T-ACTB载体构建 | 第77-78页 |
| 4.4.3 相对定量反应体系和反应程序 | 第78-81页 |
| 4.4.4 PTH转染表达CD81 | 第81-83页 |
| 4.4.4.1 PTH转染表达CD81最佳转染条件 | 第81页 |
| 4.4.4.2 PTH转染表达CD81检测 | 第81-83页 |
| 4.4.5 表达CD81受体后对HCV感染PTH的影响 | 第83页 |
| 4.5 讨论 | 第83-84页 |
| 4.6 本章小结 | 第84-86页 |
| 第五章 结论 | 第86-87页 |
| 致谢 | 第87-88页 |
| 参考文献 | 第88-95页 |
| 附录A 攻读说是期间发表论文目录 | 第95-96页 |
| 附录B 其他要说明的内容 | 第96页 |
