| 摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 引言 | 第11-13页 |
| 文献综述 | 第13-22页 |
| 1 反转录病毒概况 | 第13页 |
| 2 猪内源性反转录病毒 | 第13-17页 |
| 2.1 概况 | 第13页 |
| 2.2 形态与结构 | 第13-14页 |
| 2.3 基因组特点 | 第14-15页 |
| 2.4 蛋白质及功能 | 第15-16页 |
| 2.5 PERV的生活周期 | 第16-17页 |
| 3 基因打靶 | 第17-22页 |
| 3.1 基因打靶的概况 | 第17页 |
| 3.2 基因打靶的要素 | 第17-20页 |
| 3.3 基因打靶策略 | 第20-21页 |
| 3.4 基因打靶的应用 | 第21-22页 |
| 材料和方法 | 第22-38页 |
| 1 材料 | 第22-24页 |
| 1.1 质粒和菌株 | 第22页 |
| 1.2 工具酶和试剂 | 第22页 |
| 1.3 大肠杆菌培养基 | 第22-23页 |
| 1.4 电泳缓冲液 | 第23页 |
| 1.5 细胞 | 第23页 |
| 1.6 细胞培养过程中所用的各种培养液 | 第23页 |
| 1.7 主要仪器 | 第23-24页 |
| 2 pPCM1-tk的构建与鉴定 | 第24-33页 |
| 2.1 流程与所涉及质粒的结构 | 第24-26页 |
| 2.2 引物的设计与合成 | 第26-27页 |
| 2.3 酶切pPM-1-GFP-21 | 第27-28页 |
| 2.4 扩增5’LTR和CMVie | 第28页 |
| 2.5 连接5’LTR和CMVie | 第28-29页 |
| 2.6 构建pPCM1及鉴定 | 第29-30页 |
| 2.7 构建pPCM1-tk及鉴定 | 第30-32页 |
| 2.8 提取质粒pPCM1-tk并纯化 | 第32页 |
| 2.9 启动子效果比较 | 第32-33页 |
| 3 pPCM1-tk转染猪源细胞 | 第33-34页 |
| 3.1 Lipofectamine~(TM) 2000转染不同细胞 | 第33页 |
| 3.2 X-tremeGENE HP转染ST细胞 | 第33-34页 |
| 3.3 Entranster~(TM)-D转染ST细胞 | 第34页 |
| 4 筛选同源重组细胞并进行鉴定 | 第34-38页 |
| 4.1 确定G418筛选所使用的浓度 | 第34页 |
| 4.2 确定GANC筛选所使用的浓度 | 第34页 |
| 4.3 转染ST和SK-6细胞 | 第34页 |
| 4.4 G418和GANC对细胞进行筛选 | 第34-35页 |
| 4.5 提取细胞基因组 | 第35页 |
| 4.6 设计检测同源重组所需要的引物 | 第35-36页 |
| 4.7 PCR检验同源重组 | 第36-38页 |
| 结果 | 第38-55页 |
| 1 pPCM1-tk的构建与鉴定 | 第38-43页 |
| 1.1 酶切pPM-1-GFP-21并回收 | 第38页 |
| 1.2 扩增5’LTR和CMVie并回收 | 第38-39页 |
| 1.3 PCR扩增5’LTR-CMVie | 第39-40页 |
| 1.4 菌落PCR验证pPCM1 | 第40页 |
| 1.5 酶切验证质粒pPCM1 | 第40-41页 |
| 1.6 PCR扩增HSVtk | 第41页 |
| 1.7 菌落PCR 验证 HSVtk的插入方向 | 第41-42页 |
| 1.8 酶切验证质粒pPCM1-tk | 第42页 |
| 1.9 提取质粒pPCM1-tk | 第42页 |
| 1.10 启动子效果比较 | 第42-43页 |
| 1.11 小结 | 第43页 |
| 2 pPCM1-tk转染猪源细胞 | 第43-46页 |
| 2.1 用Lipofectamine~(TM) 2000转染不同细胞 | 第43-45页 |
| 2.2 其他转染试剂进行转染 | 第45-46页 |
| 2.3 小结 | 第46页 |
| 3 筛选同源重组细胞并进行鉴定 | 第46-55页 |
| 3.1 确定G418筛选所使用的浓度 | 第46-48页 |
| 3.2 确定GANC筛选所使用的浓度 | 第48-50页 |
| 3.3 转染及筛选ST和SK-6细胞 | 第50-51页 |
| 3.4 PCR检验同源重组 | 第51-54页 |
| 3.5 小结 | 第54-55页 |
| 讨论 | 第55-58页 |
| 1. 载体构建 | 第55-56页 |
| 2. 转染条件的优化 | 第56页 |
| 3. 同源重组细胞的筛选 | 第56页 |
| 4. 同源重组的检测 | 第56-58页 |
| 结论 | 第58-60页 |
| 参考文献 | 第60-64页 |
| 附录(缩略词表) | 第64-66页 |
| 后记(含致谢) | 第66-67页 |
| 攻读学位期间取得的科研成果清单 | 第67页 |
